房志刚,陈亚根,张健康,魏妙,张学农,2#(.苏州大学药学院,苏州市 2523;2.苏州利元医药科技有限公司,苏州市 25002)
环孢素A(Cyclosporine A,CyA)为第3代强效免疫抑制剂,已成功应用于肾脏、肝脏和心脏等器官移植手术前、后机体的排斥反应和自身免疫性疾病的治疗,自其临床应用以来,CyA显著改善了实体器官移植的近期存活率,在器官移植史上具有划时代的意义。目前临床上常用的CyA制剂,如新山地明微乳制剂(Neoral)含有增溶剂Cremophor EL,可刺激组胺释放,引起超敏反应[1]。纳米粒给药系统以其独特的吸收机制和药物保护作用等,受到国内外科研工作者的广泛关注,并取得了较为显著的成果。因此,笔者制备了CyA纳米粒(CyANP)给药系统,所用载体材料为肠溶材料Eudragit S100。该制剂可将药物定位输送到小肠特定部位,有效减少胃肠道酶系对药物的代谢作用,并促进药物吸收,其在大鼠体内的相对生物利用度为162.1%[2],并且由于不含增溶剂Cremophor EL,可显著降低过敏反应。
同时,由于目前国内、外文献对CyA-NP在体内组织分布的研究少有报道,大多研究其在动物体内的相对生物利用度。因此,本文以Neoral为参比制剂,对小鼠口服灌胃给药后CyA-NP在小鼠体内的药动学和组织分布做进一步研究。
LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津公司);Vivaflow50超滤仪(10000Da聚砜醚滤膜,德国赛多利斯公司);MS3 digital涡旋器(德国IKA公司);低速大容量多管离心机(无锡市瑞江分析仪器有限公司);FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器(江苏金坛市环宇科学仪器厂);SHZ-82型恒温振荡箱(金坛富华仪器有限公司)。
CyA(批号:0608019(N),纯度:>99.3%)、内标环孢素D(CyD,含量:>96.5%)均由福建科瑞药业有限公司提供;Eudragit S100(德国Röhm公司);Neoral(诺华制药有限公司,批号:S0049,规格:每粒25 mg);乙腈、甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯;水系三蒸水。
清洁级昆明种小鼠,♂,体质量18~24 g,苏州大学医学院实验动物中心提供,许可证号:SYXK(苏)2007-0035。
精密量取泊洛沙姆125 mg,加入125 mL蒸馏水溶解作为水相;另取CyA50 mg、200 mg Eudragit S100,加无水乙醇50 mL制成有机相;以7#骨髓穿刺针迅速将有机相注入以400 r·min-1转速搅拌的水相中。注射完毕后继续搅拌10 min,转入60℃水浴中,搅拌3 h以挥发有机溶剂,即得CyA-NP胶体溶液,并进行相关的质量评价。
结果,CyA-NP的粒径分布为单峰分布,粒径分布范围为22~100 nm,平均粒径为(43.9±0.82)nm。包封率为(98.3±0.2)%,载药量(23.9±0.1)%,回收率(97.3±0.3)%。
2.2.1 色谱条件。色谱柱:HYPERSIL-BDS C18(250 mm×4.60 mm,5 µm);流动相:乙腈-甲醇/水=55∶45(1/1);流速:1.3 mL·min-1;检测波长:210 nm;柱温:70 ℃;进样量:20 μL。
在上述色谱条件下,取空白全血、含药全血+CyD、空白心脏、含药心脏组织匀浆液样品+CyD进样分析,色谱见图1。
图1 高效液相色谱图A.空白全血;B.含药全血+CyD;C.空白心脏;D.含药心脏+CyD;1.CyA;2.CyDFig 1 HPLC chromatographyA.blank blood;B.blood sample+CyD;C.blank heart;D.heart sample+CyD;1.CyA;2.CyD
图1结果表明,小鼠血液及各组织匀浆液中内源性物质基本上不干扰CyA和内标CyD的测定,处理过程未引入新的杂质,在此色谱条件下CyA和CyD达到基线分离。
2.2.2 生物样品的处理方法[4]。取小鼠心脏、肝、脾、肺、肾各组织样品,精密称定,按10 mL·g-1加水,高速电动匀浆器匀浆后,制得组织匀浆液。精密吸取全血0.5 mL或组织匀浆1.0 mL置于15 mL具塞塑料离心管中,加入20 μg·mL-1的CyD溶液50 μL和180 mmoL·L-1盐酸溶液1 mL,涡旋混合1 min,加乙醚5 mL,密塞,水平固定于恒温振荡器上,100 r·min-1振荡15 min,4000 r·min-1离心15 min;分取醚层置于15 mL具塞塑料离心管中,加入1%偏重硫酸钠2.5 mL和95 mmoL·L-1氢氧化钠溶液1 mL,振荡(4000 r·min-1)。分取无色醚层置于5 mL具塞玻璃离心管,40℃水浴中氮气吹干,残渣加乙腈-水(70∶30)150 μL,涡旋混合2 min;加正己烷1 mL,涡旋混合2 min,3500 r·min-1离心10 min,弃正己烷层,血样重复2次,组织样品重复3次,最后一次均用0.5 mL正己烷洗涤,取下层清液20 μL进样。
2.2.3 标准曲线的制备。精密吸取空白全血0.5 mL或空白组织匀浆液1 mL,加入CyA系列工作液和CyD溶液各50 μL,使成浓度依次为0.05085、0.3051、0.5085、1.017、3.051、4.068、6.102 μg·mL-1的血样及浓度依次为 0.2542、1.525、2.542、5.085、15.25、20.34 μg·g-1的组织样品,按照“2.2.2”项下方法操作,进样,记录色谱及峰面积,以Ai(CyA与CyD的峰面积之比)对浓度C作线性回归,得到线性方程,即为标准曲线,结果见表1。
表1 全血及组织中CyA的线性方程和线性范围Tab 1 Regression equation and linear rang of CyA in blood and tissues
结果表明,在相应浓度范围内,峰面积比与浓度呈良好的线性关系。
2.2.4 回收率与精密度。取空白血样0.5 mL或组织匀浆液1.0 mL,加入浓度为3、10、30 μg·mL-1的CyA溶液50 μL,按“2.2.2”项下方法操作,记录CyA与内标峰面积之比,以测得浓度与实际浓度之比计算方法回收率(%)。以生物样品中CyA的峰面积与相同浓度CyA溶液进样后峰面积之比计算提取回收率(%)。并计算日内及日间精密度(n=5)。制备CyA在血液及各组织中的低、中、高浓度的生物样品,考察生物样本处理后室温放置12 h内的稳定性。
结果,低、中、高浓度血液和各组织样品的提取回收率均大于72%,方法回收率在78.68%~108.2%之间。血液和各组织的日内精密度小于8.6%(n=5),日间精密度小于11.5%(n=5);生物样品处理后室温放置12 h内稳定,表明此方法符合生物样品分析的要求。
取小鼠120只,随机分为20组,每组6只。实验前禁食12 h,自由饮水。前10组小鼠按25 mg·kg-1的剂量灌胃给予Neoral溶液,后10组灌胃给予等剂量的CyA-NP胶体溶液,于给药后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24 h摘眼球取血,置于以1%肝素抗凝的EP管中。随即颈椎脱臼处死小鼠,迅速取出心脏、肝、脾、肺、肾,洗去残余血液,去除多余结缔组织,滤纸吸干,称重。所有样品均置于-70℃保存备用。
应用3p97药动学处理程序,对小鼠口服Neoral和CyANP后全血的血药浓度-时间数据进行处理,确定口服给药后2种制剂均符合二室模型。Cmax、tmax为实测值,AUC采用梯形面积法计算。CyA-NP和Neoral中CyA的药动学参数结果见表2。
CyA-NP和Neoral经小鼠口服灌胃后,以不同时间各组织中CyA的含量来评价2种制剂在小鼠体内的组织分布,其小鼠各组织分布直方图见图2。
表2 2种制剂药动学参数结果(n=6)Tab 2 Pharamacokinetic parameters of Neoral and CyANP(n=6)
图2 2种制剂口服后在小鼠体内的组织分布(n=6)A.Neoral;B.CyA-NPFig 2 Tissues distribution of Neoral and CyA-NP after oral administration(n=6)A.Neoral;B.CyA-NP
由图2可见,0.5 h时CyA-NP在肝中的分布量为给药量的4.19%,在血液中的分布量为给药量的2.09%;而Neoral在肝中的分布量为给药量的4.22%,在血液中的分布量仅为给药量的1.12%。以Neoral为参比制剂,CyA-NP的相对生物利用度为162.5%。
以靶向效率(Te),相对靶向效率(RTe)和靶向指数(TI)为评价指标,考察CyA-NP相对于Neoral的靶向性。由于靶与非靶组织的质量和容量相差较大,仅以AUC不能真实反映药物向不同组织分布剂量的数据,因此引入AUC与各组织质量的乘积AUQ,能更全面地定量评价药物靶向性参数,其中血液按总重的8%计算[5,6]。AUC、AUQ、Cmax和 tmax结果见表3;以Te、RTe、TI作为评价参数,结果见表4。
由表3、表4可见,CyA-NP在体内组织中药物浓度分布趋势为肝>心脏>肾>脾>肺,而Neoral为肝>心脏>脾>肾>肺;CyA-NP在体内药物量分布趋势为肝>肾>心脏>肺>脾,而Neoral为肝>肾>心脏>脾>肺;肾、心脏的相对靶向效率RTeAUC、RTeAUQ,靶向指数TIAUC、TIAUQ均大于1,而肝的靶向指数TIAUC、TIAUQ接近于1。
表3 2种制剂口服后CyA在血液及组织中的AUC、AUQ、Cmax和tmaxTab 3 AUC、AUQ、Cmaxand tmaxof CyA in blood and different tissues after oral administration
表4 2种制剂口服后CyA在血液及组织中的Te、RTe和TITab 4 Te,RTe and TI of CyA in blood and different tissues after oral administration
CyA系一种强亲脂性多肽,与血液中各组分都有较高的结合率,且受温度影响较大,测定时温度不易控制,故选择测定全血已成为共识。目前国内、外CyA的体内测定方法主要有放射免疫法(RIA)、高效毛细管电泳法(HPCE)、荧光偏振免疫法(FPIA)和HPLC等[7,8]。前3种方法特异性差,多因受CyA代谢物的影响而使测定结果偏高;而HPLC法特异性强,测定结果不受代谢物的影响,且测定成本相对低廉。本文采用液-液萃取法对血样及组织样品进行处理,通过2次萃取、多次洗涤等步骤,去除了生物样品中的杂质,避免了杂峰的干扰。药物的保留时间在10 min以内,有利于大量样品的测定。
与Neoral给药后比较,CyA-NP给药后改变了CyA在体内的分布,使药动学参数发生变化,其中V/f(c)变小,CL(s)降低,同时AUC明显增大,体内生物利用度是Neoral的1.625倍。这可能由于口服给药时纳米粒可被胃肠道黏附,直接被摄取,或在特定部位释放吸收所致。另外,CyA-NP的体外释药具有显著的pH值依赖性,当pH>6时,CyA能从粒子中迅速并完全释放,这样既能减少胃肠道酶系对药物的代谢作用,又可在肠段特定部位吸收[3]。因此,在等剂量给药条件下,CyA-NP有助于药物的口服吸收。
组织分布研究结果表明,与Neoral给药后比较,CyA-NP给药后改变了CyA在小鼠体内的分布。由图2可知,2种制剂在肝中的分布量最大,其次为血液,并且CyA-NP在血液中的分布量高于Neoral。0.5 h时CyA-NP在肝中的分布量为给药量的4.19%,在血液中的分布量为给药量的2.09%,而Neoral在肝的分布量为给药量的4.22%,在血液中的分布量仅为给药量的1.12%,另外,血液靶向指数TIAUC、TIAUQ均大于1,表明CyA-NP对血液有明显的浓聚作用;在除肺外的其它组织,药物浓度达到高峰时的时间均相应提前,说明CyA-NP体内分布迅速,使血液及各组织中药物浓度较快达到峰值。
从靶向参数TeAUC、TeAUQ来看,与Neoral给药后比较,CyA-NP给药后对肾和心脏有一定的趋向性,且不会在肝中蓄积;而对于脾和肺,CyA-NP减少了CyA在这些器官的分布。
CyA-NP能够提高CyA的口服生物利用度,对肾和心脏的趋向性,预示着能够提高肾、心脏移植患者的治疗效果,并且与Neoral达到相同的治疗效果时所用剂量比较,本品的剂量更低,故可降低毒副作用,同时提高临床用药水平。
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