乙型肝炎免疫球蛋白聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的体外跨膜转运试验Δ

彭忠田，谭德明，黄顺玲，朱平安，3，刘菲（.中南大学湘雅医院，长沙市 40008；2.南华大学附属第一医院，衡阳市 4200；3.深圳市第七人民医院，深圳市 5808）

乙型肝炎免疫球蛋白（Hepatitis B immunoglobulin，HBIG）是针对乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的特异性被动免疫制剂，其治疗作用机制被认为是与血循环中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）特异性结合及中和HBV。而最近有研究[1～3]报道HBIG在体外细胞模型中能减少HBV的分泌或干扰包含HBV DNA中间体的核衣壳的包封。但慢性乙型肝炎患者体内HBsAg含量丰富，一般剂量的HBIG很快与循环中的HB-sAg结合，真正能进入肝实质细胞的量不足以抑制HBV，使HBIG的不能发挥应有的疗效。纳米粒是一种新型的药物载体，药物可通过溶解、包裹或吸附作用与纳米粒结合。已有研究表明，药物与纳米粒结合后，跨膜转运能力提高且药效增强[4～6]。本研究选用人正常肝细胞株QSG7701细胞为体外细胞模型，对HBIG聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（Hepatitis B Immunoglobulin Polybutylcyano-Acrylate Nanoparticle，HBIGPBCA-NP）的细胞渗透情况进行研究，以探讨药物经纳米化是否会提高HBIG的细胞渗透率，使进入细胞内HBIG的浓度增加。

1 材料

1.1 仪器

全自动紫外分光光度计（美国Beckman公司）；iCycler荧光实时聚合酶链反应（PCR）仪（美国BIO-RAD公司）；ANYTEST 2000时间分辨荧光测定仪（上海新波生物技术有限公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；恒温CO2培养箱（美国Quene公司）；IX70倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 试药

HBIG注射剂（四川远大蜀阳药业有限公司，批号：20050704，规格：100 IU·mL－1）；HBIG-PBCA-NP（中南大学湘雅医院传染病研究所，批号：200508，规格：6.0 IU·g－1）；达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM，批号：SH3002201）、胎牛血清（FBS，批号：16000-044）均购自美国Gibco公司；乙型肝炎表面抗体（Hepatitis B surface antibody，HBsAb）定量检测试剂盒（苏州新波生物技术有限公司，批号：20040610）；HBV核酸扩增荧光检测试剂盒（上海申友生物技术有限责任公司，批号：20050302）；MTT（批号：M-0793）、二甲基亚砜（DMSO，批号：D-0231）均购自美国Sigma公司。

1.3 细胞株及培养

QSG7701细胞株由中南大学湘雅医院传染病研究所保存。将QSG7701细胞接种于25 cm2培养瓶内，每瓶加入5～10 mL DMEM混合培养液（含10%FBS），置于37℃、5%CO2培养箱中孵育，每3～4 d以消化液消化传代，细胞每2～3 d换液1次。

2 方法

2.1 细胞毒性试验

采用MTT比色试验法。用含10%FBS的DMEM将QSG7701细胞配制成单个细胞悬液，以每1 cm21.5×104个接种于96孔培养板上，每孔体积200 μL。试验分8组：HBIG低、中、高浓度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）组，HBIG-PBCA-NP低、中、高浓度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）组，对照组（加细胞及10%FBS的DMEM培养基）和空白孔（不加细胞，只加10%FBS的DMEM培养基），每组设5孔。放至37℃、5%CO2恒温培养箱中，分别于培养24 h及72 h后每孔加入5 mg·mL－1MTT溶液20 μL，37℃继续孵育4 h后，吸弃孔内培养基，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，在酶标仪上选择490 nm波长，以空白孔调零，测定各孔吸光度值。

2.2 HBIG及HBIG-PBCA-NP体外跨膜转运作用研究[5]

用含10%FBS的DMEM培养基将QSG7701细胞配成单细胞悬液，以每1 cm23×105个接种于12孔培养板中，24 h后待细胞贴壁生长状态良好时进行试验，试验分7组：HBIG低、中、高浓度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）组、HBIG-PBCA-NP低、中、高浓度（0.1、0.2、0.4 IU·mL－1）组、对照组（10%FBS的DMEM培养基），每组设5孔；与细胞共孵育，分别于加药后培养2、4、8、16、24、48 h，小心吸取孔内培养上清液（保存于－20℃），待测HBsAb定量（预试验时，另设含0.1、1.0 IU·mL－1HBIG及HBIG-PBCA-NP的10%FBS DMEM培养基组，置于37℃、5%CO2培养箱培养24、48 h，以观察细胞培养条件下HBIG及HBIG-PBCA-NP的稳定性）。

通过下列方法计算细胞内HBIG浓度和HBIG渗透率：细胞内HBIG浓度＝药物终浓度－培养上清液浓度；HBIG渗透率＝（细胞内药物浓度/药物终浓度）×100%。

采用时间分辨免疫荧光分析法进行HBsAb定量检测以计算HBIG浓度。按照试剂盒操作说明进行。取试剂盒中所附的阴性对照、阳性对照、参考标准品及待检测样品[即“2.2”项中（保存于－20℃）培养上清液]各100 μL，按顺序加入微孔反应条中并加贴封片；室温下，振荡仪缓慢振摇孵育1 h；洗板4次，拍干；每孔加入100 μL铕标记物工作液，并加贴封片；室温下，振荡仪缓慢振摇孵育1 h；洗板6次，拍干；每孔加入试剂盒中所附的增强液100 μL，并加贴封片；室温下，振荡仪缓慢振摇孵育5 min；用时间分辨荧光测定仪测定HBsAb浓度值，并转化为HBIG浓度。

2.3 统计学分析

3 结果

3.1 细胞毒性试验结果

各组吸光度值结果见表1。

表1 各组吸光度值比较Tab 1 Comparison of absorbance value in each group

由表1可见，各试验组之间以及试验组与对照组之间吸光度值均无统计学差异（P＞0.05），表明所用药物在本试验浓度下无细胞毒性作用。

3.2 HBIG及HBIG-PBCA-NP体外跨膜转运作用结果

预试验研究表明，含0.1、1.0 IU·mL－1HBIG及HBIG-PBCA-NP的DMEM培养基置于37℃、5%CO2培养箱培养24、48 h后，HBIG浓度与相应的标准浓度（即100 IU·mL－1的HBIG配制的0.1、1.0 IU·mL－1HBIG，6.0 IU·g－1的HBIG-PBCA-NP配制的0.1、1.0 IU·mL－1的HBIG-PBCA-NP）比较无显著性差异（P＞0.05），表明HBIG及HBIG-PBCA-NP稳定性好。

在不同时间点，各组细胞内HBIG浓度测定值见表2，各组 HBIG渗透率见图1。

表2 各组不同时间点细胞内HBIG浓度（IU·mL－1）Tab 2 Intracellular HBIG concentration of cells in each group at different time（IU·mL－1）

图1 各组不同时间点HBIG的渗透率（%%）Fig 1 The penetrability ratio of HBIG in each group at different time（%%）

由表2可知，细胞培养液中所加药物终浓度分别为0.1、0.2、0.4 IU·mL－1时，HBIG组和HBIG-PBCA-NP组细胞内的HBIG浓度均随培养时间的延长而增加，至24 h时已基本达最大值；HBIG组HBIG的胞内浓度尽管随着胞外药物浓度的增加、培养时间的延长而有所提高，但与HBIG-PBCA-NP组相比，后组升高更为明显，且后组HBIG的胞内浓度在各时间点均明显高于前组。至24 h时，HBIG-PBCA-NP组HBIG的胞内浓度约为HBIG组HBIG的胞内浓度的1.5倍。经统计学分析，2组之间比较具有显著性差异（P＜0.05）。

由图1可知，HBIG-PBCA-NP组HBIG渗透率均明显高于HBIG组，两两相比具有统计学意义（P＜0.05）。

4 讨论

研究[7]表明，IgG能通过体外跨膜转运作用跨越不同物种的上皮细胞和内皮细胞屏障。QSG7701细胞是人正常肝细胞株，以上皮样细胞为主，因此本试验以此细胞株为模型研究HBIG的体外跨膜转运作用。

MTT结果表明，HBIG及HBIG-PBCA-NP无明显细胞毒性作用，不影响试验研究。高、中、低浓度的HBIG及HBIGPBCA-NP跨膜转运研究结果证明：纳米化能增强HBIG的细胞内渗透能力，提高HBIG的渗透率和细胞内浓度，使进入细胞内的HBIG的量增加。纳米化后细胞内的HBIG浓度约是未纳米化的1.5倍，这为HBIG更有效地进入细胞内、减少HBV的分泌或干扰包含HBV DNA中间体的核衣壳的包封创造了良好的条件。但在动物细胞模型中纳米化的HBIG是否仍有上述作用，值得深入研究。

HBIG纳米粒较HBIG更容易跨膜转运入肝细胞内的机制主要与肝细胞系的内摄纳米粒作用有关。目前普遍接受的观点是纳米载体可携带大分子药物，通过内吞途径进入细胞，完成对吸收性上皮细胞的药物转运。药物纳米化后肝细胞跨膜转运能力增强的机制目前尚不十分清楚，主要有如下解释：（1）纳米粒通过细胞内吞作用进入细胞；（2）纳米粒被细胞膜吸附，黏附于细胞膜上，造成局部药物浓度过高而产生浓度梯度，有利于药物由胞外向胞内扩散；（3）药物可与载体形成离子对，有利于药物的跨膜转运；（4）载药纳米粒可以改变膜运转机制，增加药物对生物膜的透过性，有利于细胞内药效发挥[8]。

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[3]Peng ZT，Tan DM，Huang SL，et al.Inhibition of HBs-Ag and HBV DNA secretion by HBIG nanoparticles（HBIG-PBCA-NP）in vitro[J].J Hepatology International，2008，2（suppl 2）：S172.

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