应用AllGlo探针检测对虾白斑综合征病毒研究

陈定虎，杨雷亮，冯 云，张建威 ，潘 星，徐守振

(1.中山出入境检验检疫局，广东 中山 528403；2.青岛农业大学，山东 青岛 266000)

对虾白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是当前严重危害对虾养殖业的最主要的病毒之一。自20世纪90年代初首先在我国台湾地区发生以来，至今已经给世界各国的对虾养殖造成了巨大的经济损失，而且WSSV宿主十分广泛，常导致中国明对虾（Penaeus chinensis）、日本对虾（Penaeus japanicus）、印度对虾（Penaeus indicus）、南美白对虾（Penaeus vannamei）、蓝对虾（Penaeus stylirostris）、褐对虾（Penaeus aztecus）、桃红对虾（Penaeus duorarum）、斑节对虾（Penaeus monodon）、长毛对虾（Penaeus Penicillatus）、 墨吉对虾（Fenneropenaeus merguiensis）等感染发病及大规模死亡，许多蟹类对它也十分敏感。前人已经报道了许多不同的检测方法，如普通PCR法，实时荧光PCR检测法。普通PCR法能够检测出微量的病毒，而实时荧光PCR检测法则又比普通PCR法检测的灵敏度高，而且

可以防止交叉污染。由于WSSV在对虾体内含量非常低，特别是在侵染初期浓度更低，但是即使对虾将及为微量的病毒带入虾池，由于WSSV具有水平传播的特点，在合适的环境条件下，该病毒也会很快繁殖且传播开来，给对虾养殖造成毁灭性的损失，因此还必须不断研究更为灵敏的检测方法，才能将该病毒传播的可能性降到最低限。笔者应用最新的荧光PCR探针即AllGlo探针来检测WSSV，以期提高检测对虾的灵敏度。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品 根据中山市历年温度的变化，在对虾病毒最适宜繁殖发病的时节即9—10月份，从中山市对虾养殖基地采表现白斑症状的南美白对虾样品。

1.1.2 主要仪器 3K15型台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司），DYY－11型普通电泳仪（北京六一仪器厂）；PC－818A－02型梯度PCR仪（中科公司）；ABI7500荧光PCR仪（美国ABI公司）等。

1.1.3 试剂 动物基因组DNA提取试剂盒以及Taq聚合酶 ，琼脂糖，GREEN I核酸染料，DNA分子量标准物等均购自于广州普博生物技术公司；普通PCR使用TAKARA公司生产的（Master Mix）；荧光PCR使用上海超世生物公司生产的CS Qpcr Master Mix。

1.1.4 普通PCR引物设计 根据 GenBank中 WSSV:AF332093.1，发布的基因序列，运用DNAStar软件首先设计出对虾主要病毒普通PCR鉴定引物，即：WSSV-P1：5'-gat gag aca gcc caa gtt gtt aaa c-3'；WSSV-P2：5'-gca tca act tcc aca gct tta tc-3'扩增片段预期长度为599 bp，并送大连宝生物公司进行序列测定。

1.1.5 荧光PCR引物和探针的设计 根据普通PCR扩增产物测序结果，采用AllGlo探针专用设计软件设计荧光PCR引物及其AllGlo探针并进行MARTM荧光标记：WSSV-FP：5'-AATCAATGAAGCATCCGAAA CA-3'；WSSV-RP：5'-TTTCATATTCT TTCCTTTTATCCCTT-3'；WSSV-P：5'-MAR-TGCTCCTGCAATAGCTGG C-MAR-3'。将探针（P）、引物（FP，RP）用水溶解成终浓度为100 μmol/L，并将引物探针稀释至10μmol/L备用。

1.2 方法

1.2.1 对虾样品总DNA提取 采用广州普博生物技术公司生产的动物DNA提取试剂盒提取。

1.2.2 普通PCR扩增步骤

扩增体系（25 μL）：在 0.2 mL 离心管中加入宝生物工程（大连）有限公司生产的Premix Taq预混液12.5 μL，上下游引物各1μL，对虾样品总DNA1μL，加灭菌蒸馏水至25 μL。

PCR 循环条件：94℃ 3 min；94℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72℃延伸10 min，然后4℃保存反应产物，以健康对虾DNA为阴性对照。

1.2.3 琼脂糖电泳分析

用1×TAE缓冲液和琼脂糖按1.5%的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至55℃。加入GREEN I核酸染料或溴化乙锭（1 μg/mL），混合均匀，倒入凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，拔出梳子，加入适量的TAE缓冲液（缓冲液没过凝胶上表面约1 mm）。取1 μL加样缓冲液与5 μL PCR反应液混合均匀，然后分别将其和合适的DNA分子量标准物加入样品孔中。接通电源以电压5 V/cm进行电泳，当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，停止电泳。将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照像记录。并对产物进行回收，送大连宝生物公司进行序列测定。

1.2.4 实时荧光PCR检测步骤

采用上海超世生物公司研发的Hot Start PCR Master MixⅠ并按照下表加样进行荧光PCR检测。

2 结果与分析

2.1 普通PCR检测结果见图1。

2.2 序列分析结果

经过宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定，发现扩增片段共有599 bp大小，与GenBank数据库中WSSV序列比较得知，与荷兰（AF369029）、伊朗（AY870344）、新加坡（AF403003）、韩国（U89843）及台湾（AF440570）报道的WSSV序列同源性高达99%，序列如下：GATGAGACAGCCCAAGTTGTAAACA GGCCGTTGATGAAAAATACGATGAA TTATTAGAAGATAAGGTTGAAGAAA TGAGACCGGATATAATCAATGAAGC ATCCGAAACATATGATAAACTTGCTG CTGATATGATAAGAGAGGTAGACAC TAGTGGTGTTATTGCTCCTGCAATAG CTGGCACAGTGGCAAGAACTATCAA TAATTTAAGGGATAAAAGGAAAGAA TATGAAAAGAGGCTATGGACATTAG CCTACAAACCATGGAGAAGATATGT ACAAGCAATTACAGTGATGGAATTTC GTTTATCATATAAAGACCTGACTGTC CATGCCAATTCCGATACATATTTAAC ATTCCCTTTTTTAAGAATAAAAAAGA TCGCCTATATTAATAACGACCGCGCC AGCCCCGTGAACTGCTCCTTGTCAGT GTCTTATCCCAACAAGTCCGAGTGGG GAAATGATAACGGAGTTGGACGTAA GGTTGACATACACATCAGAAGAAAT GATTTACAGGAAAAGGATCTTTACCT GTCTGTTATTTGTATGTTAGATACTG ATTTTTCAGGATATGATAAAGCT GTG GAAGTTGATGC

2.3 实时荧光PCR检测WSSV

如图2所示，阳性反应呈现典型的S曲线，说明本检测探针和引物设计合理。当反应体系、扩增条件都不变，将模板DNA以106拷贝/μL为起点，10倍梯度稀释至101，通过Avogadro常数（摩尔常数）和WSSV模板DNA分子量计算其拷贝数（拷贝数/mL=DNA 浓 度 g/mL×6.02×1023/DNA分子量g/mol），然后按照设计稀释到不同的梯度，再进行荧光PCR检测，以测定本探针的灵敏度，标准曲线如图3，结果如图4和表1，表明当样品DNA浓度低至100拷贝/μL时即可以有效扩增，但在103/μL之上时结果最佳，因此在检测对虾体内WSSV病毒时，样品DNA量不可太少。用Taqman标记的探针检测相同量的样品时，MAR标记的探针（FAM 通道）CT值与FAM标记的探针的CT值没有明显的区别，但是MAR标记的探针的信号强度要比FAM标记的探针约高40%（结果未显示）。

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3 讨论

对虾白斑综合症病毒（WSSV）是危害对虾主要病毒之一，由于目前国内外对该病毒还不能进行细胞培养，在免疫学检测方面还难以取得进展，而且该病毒在对虾体内含量低，所以必须研究高灵敏度的检测方法。PCR检测技术具有快速、灵敏、特异性强的特点，已被广泛应用于动植物和人类等病原物的检测。近年来国内外有许多学者已经有应用PCR技术成功检测WSSV的报道[1-6]。荧光定量PCR技术是在普通PCR技术的基础上增加了可供仪器自动检测的荧光基团标记的探针，具有比普通PCR技术更为灵敏和快速及防污染的特点。而目前荧光探针几乎均为Taqman探针，但有人在用Taqman探针做检测中发现无论是淬灭基团Tamra、BHQ还是MGB，均对PCR反应有不同程度的抑制作用，对于极低拷贝数的待检样品，为提高检测灵敏度需要调高探针浓度，但浓度越高抑制作用越严重；为减缓抑制作用，可调低探针工作浓度，但却无可避免地也降低了探针检测的灵敏度，导致出现漏检现象。既要求探针在进行检测时有高灵敏度，同时又不能有明显的PCR抑制作用，这个问题一直困扰着一线的检测技术人员。

为解决上述矛盾，本课题采用AllGloTM探针作为检测工具。AllGlo探针是目前唯一一款在高工作浓度下既有高灵敏度，同时也不会对PCR反应有明显抑制作用的探针，非常适合于极低浓度病原物的检测，且特别适合于多重荧光定量PCR的检测。与TaqMan探针相比较，AllGlo探针有许多新的特点：由于AllGlo每个探针上都能释放出2个发光的染料基团，没有淬灭基团，使得AllGlo探针亮度更高，几乎是TaqMan探针的二倍，从而大大提高了检测灵敏度；而且该探针使多重PCR检测更为简单。AllGlo探针有MAR、JUP、SAT、URA、NEP 5 种颜色，分别对应于常用的 FAM、VIC、TAMRA、ROX和Cy55个检测通道。本研究就是用MAR基团标记，该基团吸收波长485～505 nm，发射波长515～530 nm，对应FAM检测通道，对PCR反应没有抑制作用。与TaqMan探针和MGB探针不同，AllGlo探针即使在高浓度下也不会抑制PCR反应。另外它比TaqMan探针特异性更强，短链的All Glo探针，其Tm=55～60℃，仅有15～16个核苷酸的长度，使用通用程序，热循环在95℃和60℃之间，其高特异性，足以检测到单点突变。

由于AllGlo探针对于单碱基差异比较敏感，探针越短敏感度越高，即便模板发生一个碱基突变而导致与探针错配，也有可能无法检测出信号。对于检测变异频率高或亚型较多的病毒而言，这款探针的确存在着一些不足。所以为更好地发挥AllGlo探针的多重检测作用，进行探针设计时须尽可能地选择保守程度高的DNA序列区域。若无法找到理想保守区域时，一方面可考虑AllGlo结合兼并碱基的设计策略；另一方面也可考虑采用单重检测，此时建议结合使用Taqman探针，因为这类探针即便与模板有一到几个碱基错配依然有可能检测出信号，这对于防止漏检有一定的积极作用。

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