二氢杨梅素联合阿霉素抗乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的体外研究

周防震，张晓元，郭 勇

1.华南理工大学生物科学与工程学院(广东 广州 510006)

乳腺癌发病率高，居女性恶性肿瘤的首位[1]。阿霉素(Adriamycin, ADM)是在临床上广泛应用的一种化疗药物,具有抗瘤谱广、 抗瘤作用强等特点, 特别是对乳腺癌有显著疗效[2],但在临床肿瘤化疗中有严重的不良反应，尤其是心脏毒性限制了阿霉素的临床应用。因此努力寻找有效的药物和最优化的治疗是当前研究的重点。二氢杨梅素(Dihydromyricetin，DMY)，化学名为3,5,7,3，4，5，-六羟基-2,3双氢黄酮醇，是从藤茶(Ampelopsis grossedentata)等植物茎叶中提取的一种二氢黄酮醇化合物。研究表明DMY具有抗氧化、镇痛、止咳、广谱抑菌、保肝护肝、降血糖、降血脂、增强人体免疫力等多种生理活性[3]。近年来其抗肿瘤作用日益引起人们的重视。已有资料显示，DMY对乳腺癌MCF-7细胞、鼻咽癌HK-1细胞、肝癌Bel-7402细胞、白血病HL-60、K562细胞和肺癌H1299细胞[4～6]，都有较强的体外抑制作用。但DMY联合化疗药物共同作用于癌细胞的体外作用研究尚未见报道。本研究旨在探讨DMY是否可以通过与治疗乳腺癌的常用药物ADM联合,提高ADM的抑癌作用，减少用药量及减低其不良反应,以期为临床提高乳腺癌的治疗效果提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1材料乳腺癌细胞株MDA-MB-231由暨南大学生物工程研究所孙奋勇教授惠赠。注射用盐酸阿霉素购自浙江海正药业股份有限公司。DMY(99%，HPLC)购自上海同田生物公司。DMEM、胎牛血清购自Invitrogen公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜 (DMSO)购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 乳腺癌细胞株MDA-MB-231培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,37℃、 5%CO2温箱中常规培养。

1.2.2 肿瘤细胞体外增殖抑制实验 采用 MTT法[7]分别检测DMY和ADM两药的单用和联用的效应。实验设实验组、细胞对照组和空白对照组。将对数生长期的MDA-MB-231细胞稀释成2.8×104/ml的单细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔180 μl,空白组仅加入不含细胞的完全培养基,置于37℃、5%CO2培养箱内培养。12 h后在药物组中加入20 μl含不同浓度的DMY和ADM的完全培养基，使其终浓度分别为5、10、20、40、80 μg/ml和0.625、1.25、2.5 、5、10 μg/ml。每个浓度 5个平行孔,两药联用比例为1∶1方案。实验组亦给予不同浓度的含药培养基,细胞对照组和空白组均给予完全培养基。当药物作用48 h后,除去上清培养液,每孔中加入MTT(5 mg/ml)20 μl，37℃继续培养4 h，除去含MTT的培养液，往每孔加入200 μl DMSO，轻轻振荡，使细胞中形成的甲瓒结晶充分溶解，然后在酶标仪上检测570 nm的光吸收值(A)，按下式计算药物对肿瘤细胞增殖的抑制率(IR)=(1-实验组A值/细胞对照组A值)×100%。以药物浓度为横轴，抑制率为纵轴，绘出增殖抑制曲线。以药物浓度的对数与抑制率进行直线回归并求出IC50。

1.3统计学分析应用SPSS16.0 软件进行统计学分析，运用Microcal Origin 6.0软件进行作图。

2 结果

2.1 DMY和ADM对MDA-MB-231的抗增殖作用比较DMY的DMSO溶液(16.7 μg/ml)的紫外扫描光谱图见图1A，在291 nm处有最大吸收峰，与文献报道一致[3]。实验中DMSO浓度<0.05%，该浓度对MDA-MB-231细胞的增殖没有影响(数据未列出)。DMY或ADM单用48 h，随着药物浓度增加其效应均增加(图1B、图1C和表1)。DMY和ADM作用MDA-MB-231细胞48 h的IC50值分别为54.8 μg/ml和1.3 μg/ml。

2.2两药单用和联用的效应按照中效方程式直线回归计算出斜率(m)、相关系数(r)及中效浓度(Dm)，见表2。再计算出两药合用时出现不同效应时的合用指数CI，从而判断两药在不同效应时各自所需药物浓度之间相互作用，见表3。然后以效应(fa)为横坐标，合用指数(CI)为纵坐标作图，见图2。随着用药剂量的增大，两种药物对肿瘤细胞MDA-MB-231增殖抑制效应也增强；两药合用作用于指数增殖期的MDA-MB-231细胞，当fa=0.75，即使75%左右的肿瘤细胞生长受抑制时，CI≈1，两药联合效应相加；当fa<0.75, CI<1，两药联合产生协同效应；当fa>0.75时，两药合用效应拮抗。两药在低浓度合用时对MDA-MB-231细胞可以产生较好的协同作用。抑制效应为0.70时，DMY与ADM同时应用，相对于它们单独应用并取得相同效应时的剂量DMY减少了77.6%，而ADM减少了50.3%。

图1 DMY的紫外吸收光谱及DMY或ADM单用对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用

表1 两种药物单用及合用在不同浓度(μg/ml)时的效应(fa)(n=6)

表2 DMY和ADM单用及合用时的斜率(m)、中效浓度(Dm)和相关系数(r)

表3 两种药物合用时在不同效应(fa)时的合用指数(CI)

图2 DMY与ADM合用时的效应与合用指数曲线

3 讨论

二氢杨梅素又名蛇葡萄素，广泛存在于葡萄科蛇葡萄属植物中[9,10]，其中又以显齿蛇葡萄幼嫩茎叶(民间称“藤茶”)中含量最高，广泛分布于我国长江流域以南，是一种古老的药食两用植物，长期作为类茶植物和中草药在民间广泛使用。在藤茶的春夏幼嫩茎叶中，黄酮类化合物占资源干重的35%～45%，其中二氢杨梅素又占资源干重的20%～30%，其主要活性成分二氢杨梅素(DMY)是目前国内外发现的二氢黄酮类化合物中单体含量最高的植物[3]。藤茶中二氢杨梅素不仅含量丰富，且毒性极低[11]，具有开发为抗肿瘤药物和化疗药物增敏剂的巨大潜力。已有研究表明二氢杨梅素能在体外抑制多种肿瘤细胞的生长，并能诱导细胞的凋亡，其作用机制可能为①诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡[12,13]；②抑制肿瘤细胞侵袭和转移[14,15]；③抑制肿瘤血管生成[16]；④抑制端粒酶活性[17]等。本研究以人乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231为研究对象，结果表明二氢杨梅素具有抗MDA-MB-231细胞增殖的作用，作用48 h的IC50值为54.8 μg/ml，其抗癌作用机制值得进一步研究。

阿霉素作为一种周期非特异性广谱抗癌药物,对多种肿瘤均有明显疗效，已广泛应用到乳腺癌的临床化疗中。但其对多个器官具有毒副作用(胃肠道反应、骨髓抑制、心脏毒性等)，特别是心脏毒性[18]；那么，在治疗效应得到保证的前提下如何降低其使用浓度和毒副作用，是肿瘤防治的棘手问题。本研究结果表明，当fa≤0.75时两药联合产生协同效应，即两药在低浓度合用对MDA-MB-231细胞可以产生较好的协同作用。抑制效应为0.70时，DMY与ADM同时应用，相对于它们单独应用并取得相同效应时的剂量DMY减少了77.6%，而ADM减少了50.3%。ADM用药剂量的减少导致药物毒性的减弱并因此改善整体的治疗效果，暗示DMY可能对化疗药物ADM具有增敏作用。但是，DMY是参与了细胞对ADM的摄取、降解、代谢发挥作用，还是本身或其降解代谢过程中的成分与ADM相互作用而发挥作用，还有待进一步证实。可以肯定的是，DMY本身对MDA-MB-231有较好的抑制增殖效应，且可作为一种安全、有效、廉价的中药，联合ADM使用能够降低ADM的剂量，因此，可以推测其作为临床辅助ADM杀灭乳腺癌细胞，降低ADM的毒副作用会有较好的应用前景。

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