霞水母提取物抗凝血作用的初步研究

汤鲁宏,邓 超 ,林 丹 ,陈 伟

江南大学医药学院药化与药分研究室,无锡 214122

据世界卫生组织(WHO)调查发现,心脑血管病是人类致命的头号“杀手”。目前临床上采用的抗血栓药物如阿司匹林有明显的胃肠道不良反应;抗凝血药肝素,近年来发现不能抑制与纤维蛋白结合的凝血酶,这已成为血栓复发的关键因素,因此,研究安全有效、适于长期甚至终生服用的抗凝血、抗血栓药物具有重要意义[1]。据报道,鲨鱼软骨中含有大量的黏多糖,具有抗凝血、溶血栓等生理功能;张新江从陶氏太阳海星(Solaster dawsoni Verril1)中分离制得的海星酸性黏多糖有缓和的抗凝血作用;包承鑫报道从刺参[Stichopus japonicus(Selenka)]体壁中提取的一种黏多糖,对弥漫性血管内凝血(DIC)和血栓形成具有较强的抑制效果。

霞水母(Cyanea nozakii)俗称麻蜇,属于腔肠动物门(Coelenterata)钵水母纲(Cyphozoa)、霞水母属(Cyanea),其伞状体的直径可达 1.5～2 m,是水母类群中最大的一种。关于以霞水母(Cyanea nozakii)为天然海洋生物资源,分离提取其生物体的各种成分并对其生物活性物质进行系统筛选和评价的研究,在国内外尚未见任何报导。本实验以霞水母这一灾害物种为原料,对从中提取的活性物质进行了抗凝血作用的研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

霞水母:采于南通吕四港,冷冻保存。霞水母提取物:参照相关文献方法并进行改进,霞水母通过酸溶酶解后进行冷冻干燥得到的淡棕色粉末,使用前溶解在蒸馏水中(具体的制备方法参见已向国家申请的专利:200710171189.0)。已经过急性毒性实验证明该提取物无毒或毒性很小,最大安全剂量在15000 mg/kg以上。

1.2 实验动物

健康雄性 ICR小白鼠,4 w,体重18～22 g,由扬州大学比较医学中心提供[批准号:SCXK(苏)2007-0001]。购回后饲养 3 d开始实验以适应环境。

1.3 实验仪器和试剂

注射器(苏州林华塑料制品有限公司);电子精密天平(酶特洛-托利多仪器(上海)有限公司);秒表计时器(上海手表五厂);TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂);玻璃毛细管(华西医科大学仪器厂)APTT、PT试剂盒(上海太阳生物技术有限公司)生理盐水又本实验室自制。

1.4 实验方法

1.4.1 剂量设计及实验动物分组

取 50只小白鼠随机分为 5个组,每组 10只。其中 3组为霞水母提取物低、中、高剂量组,第 4组为空白对照组,第 5组为阳性对照组。霞水母提取物试验组按人体日食推荐量 7 g/人(成人按每人 70 kg体重计)来设计动物实验剂量,分别为 50、100、200mg/kg(相当于人体日食推荐量的 0.5、1、2倍),空白对照组给予 0.5 mL/只生理盐水,阳性对照组给予 0.5mL/只华法林,其剂量根据人体体表面积(成人按每人 70 kg体重计)是小鼠体表面积(20 g)的 387.9倍来计算,人体服用的预防剂量为 3mg/d,换算成小鼠的剂量为 0.4mg/kg。然后进行下列各项抗凝血指标的测定。

1.4.2 体内出血时间测定

采用小鼠断尾法。小鼠连续灌胃 7 d后,将小鼠固定,用利剪将小鼠尾尖 3 mm(提前标记)处横断,待血液自行溢出开始计时。每隔 30 s用滤纸吸去血滴一次,直至血液自然停止,以滤纸吸时无血为结束时间,此时间为体内出血时间[3]。

1.4.3 体内凝血时间测定

采用毛细玻管法。小鼠连续灌胃 7 d后,用毛细玻管从小鼠眼睛内眦取血,自血液进入毛细管开始计时至充满时离开,每隔 30 s从一端断毛细管一次,当毛细玻管内血液出现丝状物时计时结束,为凝血时间[3]。

1.4.4 体外凝血时间测定

取试验样品、生理盐水(空白对照组)、华法林(阳性对照组)各 0.1m L,分置于 10支试管中,取正常小鼠拔眼球取血,将血液直接滴入刻度试管中至约 0.7mL,轻轻混匀并计时,每隔 5 s倾斜试管一次,观察表层血液是否沿试管移动,至凝固时停止计时,为体外凝血时间[3]。

1.4.5 APTT(活化部分凝血活酶时间)、PT(凝血酶原时间)的测定

按照上述实验动物分组方案,连续灌胃 3 d。末次给药1 h后,从小鼠眼睛内眦采血 1mL,置于含有1/10体积 0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝液(1份抗凝液 +9份全血)的塑料离心管中,轻轻颠倒混匀,3000 rpm离心 15 min。收集上层液,-20℃冻存。然后按照试剂盒操作逐项进行测定。

1.4.6 实验数据处理

实验数据用 SPSSv11.0进行单因素方差分析统计处理。

2 结果与讨论

2.1 体内出血时间测定

试验组小鼠的体内出血时间均比空白对照组的延长,且低、中剂量组与空白对照组的差异具有高度显著性 (P＜0.01),高剂量组与空白对照组的差异具有显著性(P＜0.05)。表明霞水母提取物能延长小鼠的体内出血时间,增强其抗凝血功能。试验组各剂量组之间差异不显著(P＞0.05)。试验组小鼠的体内出血时间均比阳性对照组缩短,结果见表 1。

表 1 霞水母提取物对小鼠体内出血时间的影响(n=10,±s)Table 1 Effect of extract from Cyanea nozakii on the bleeding time in vivo ofm ice(n=10±s)

表 1 霞水母提取物对小鼠体内出血时间的影响(n=10,±s)Table 1 Effect of extract from Cyanea nozakii on the bleeding time in vivo ofm ice(n=10±s)

注:与空白对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01 Note:Compared with normal group*P＜0.05,**P＜0.01

组别Group剂量(mg/kg◦d)Dosage时间(s)Time空白对照组Normal control 0 746.88±196.83低剂量组Low dosage 50 1395.14±211.71**中剂量组Middle dosage 100 1987.01±313.80**高剂量组High dosage 200 1265.73±265.00*阳性对照组Positive control 0.4 2112.25±102.13**

2.2 体内凝血时间测定

试验组的小鼠体内凝血时间均比空白对照组的延长,且中剂量组与对照组的差异具有高度显著性(P＜0.01),表明霞水母提取物能延长小鼠体内凝血时间。其中低剂量组与中剂量的差异具有高度显著性(P＜0.01),中剂量组与高剂量组具有显著性差异(P＜0.05),与阳性对照组相比,小鼠的体内凝血时间有所缩短,结果见表 2。

表 2 霞水母提取物对小鼠体内凝血时间的影响(n=10±s)Table 2 Effectof extract from Cyanea nozakii on the blood clotting time in vivo ofm ice(n=10±s)

表 2 霞水母提取物对小鼠体内凝血时间的影响(n=10±s)Table 2 Effectof extract from Cyanea nozakii on the blood clotting time in vivo ofm ice(n=10±s)

注:与空白对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01 Note:Compared with normal group*P＜0.05,**P＜0.01

组别Group剂量(mg/kg◦d)Dosage时间(s)Time空白对照组Normal control 0 345.53±103.59低剂量组Low dosage 50 383.36±144.13中剂量组Middle dosage 100 649.96±124.51**高剂量组High dosage 200 427.95±86.55*阳性对照组Positive control 0.4 729.31±36.29**

2.3 体外凝血时间测定

试验组小鼠体外凝血时间均高于对照组,且中剂量组、高剂量组与对照组比较,差异有高度显著性(P＜0.01),表明霞水母提取物能够延长小鼠体外凝血时间。其中低剂量组与高剂量之间的差异具有高度显著性(P＜0.01)。各试验组的小鼠体外凝血时间均比阳性对照组缩短,结果见表 3。

表 3 霞水母提取物对小鼠体外凝血时间的影响(n=10±s)Table 3 Effectof extract from Cyanea nozakiion the blood clotting time in vitro ofmice(n=10,±s)

表 3 霞水母提取物对小鼠体外凝血时间的影响(n=10±s)Table 3 Effectof extract from Cyanea nozakiion the blood clotting time in vitro ofmice(n=10,±s)

注:与空白对照组比较**P＜0.01 Note:Compared with normal group**P＜0.01

组别Group剂量(mg/kg◦d)Dosage时间(s)Time空白对照组Normal control 0 22.94±6.50低剂量组Low dosage 50 39.02±9.79中剂量组Middle dosage 100 71.60±2.84**高剂量组High dosage 200 143.30±25.78**阳性对照组Positive control 0.4 156±26.30**

2.4 APTT、PT测定

试验组中各剂量组的 APTT、PT值均比空白对照组延长(P＜0.05),说明霞水母提取物能够抑制内源性途径和外源性途径凝血酶的产生,且对其内源性途径的抑制作用大于外源性途径。其中,低剂量组与中剂量组的 APTT比较有显著性差异(P＜0.05),各剂量组的 PT值之间无显著性差异(P＞0.05)。阳性对照组主要是通过抑制外源性途径凝血酶的产生,结果见表 4。

表 4 霞水母提取物对小鼠APTT、PT值的影响(n=10,±s)Table 4 Effectof extract from Cyanea nozakii on the APTT、PT ofm ice(n=10±s)

表 4 霞水母提取物对小鼠APTT、PT值的影响(n=10,±s)Table 4 Effectof extract from Cyanea nozakii on the APTT、PT ofm ice(n=10±s)

注:与空白对照组比较 *P＜0.05,**P＜0.01 Note:Compared with normal group*P＜0.05,**P＜0.01

组别Group剂量(mg/kg◦d)Dosage活化部分凝血活酶时间(s)APTT延长Prolong凝血酶原时间(s)PT延长Prolong空白对照组 Normal control 0 28.79±4.12 - 11.83±1.52 -低剂量组 Low dosage 50 50.25±10.93** 74.53% 17.66±4.12* 49.27%中剂量组Middle dosage 100 59.73±6.43** 107.46% 21.86±3.41** 84.78%高剂量组 High dosage 200 53.15±6.43** 84.62% 20.03±1.82** 69.37%阳性对照组 Positive control 0.4 48.23±4.38** 67.52% 23.12±0.92** 95.44%

3 结论

本实验首先测定了霞水母提取物对小鼠体内出血时间、体内凝血时间及体外凝血时间的影响,研究结果显示该提取物能够显著延长小鼠体内出血时间、体内凝血时间及体外凝血时间,因此初步认为霞水母提取物具有抗凝血作用。

APTT和 PT是临床凝血功能检测中最常用的 2个参数。其中 APTT主要用于检测机体的内源性凝血系统,其延长或缩短分别反映凝血因子Ⅱ、V、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ的血浆水平降低或增加。PT则检测机体的外源性凝血系统,其延长或缩短分别反映凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ的血浆水平降低或增加。本研究表明,霞水母提取物对小鼠 APTT和 PT均有显著影响,提示该提取物的凝血机理可能是通过内源性凝血途径和外源性凝血途径共同起作用的。

综上可知,霞水母提取物中含有具抗凝血活性的有效成分,但其化学本质及其发挥抗凝血作用的详细机制还需进一步探讨。

1 WeiYX(魏玉西),Li J(李敬),Zhao AY(赵爱云),et al.The progress of investigate the anticoagulated blood of active compound from marine life.Chin JMarine Drugs(中国海洋药物杂志),2006,25:47-50.

2 Lin XY(蔺新英),Guo DM(郭冬梅),Su WN(苏维娜).Study on the anti-coagulation effectofextract from black curd beans.Chin J Gerontology(中国老年学杂志),2006,26:1081-1082.