两种方法测定灯盏细辛注射液中细菌内毒素含量

田雁钰

(南阳市食品药品检验所,河南 南阳 473061)

灯盏细辛注射液是中药成方制剂,具有活血祛瘀,通络止痛等功效。常用于瘀血阻滞,中风偏瘫,肢体麻木,口眼歪斜,言语謇涩,胸痹心痛,缺血性中风,冠心病心绞痛等上述症候者。《中国药典》2010年版一部[1]标准仅收载其热原检查法,操作繁琐,干扰因素多。本文对灯盏细辛注射液采用凝胶法和动态浊度法测定其细菌内毒素含量,验证了灯盏细辛注射液进行内毒素定性检查与定量检测的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

灯盏细辛注射液,批号：20070136,20070816(云南生物谷灯盏花制药有限公司);0703112,0705126(深圳市生物谷制药药业有限公司)。样品均按质量标准进行热原检查,结果均符合规定。

定量用鲎试剂(标示灵敏度 0.03EU◦ml-1),批号：20070921,1.2ml◦支-1(湛江博康海洋生物有限公司)。

凝胶用鲎试剂(TAL)标示灵敏度(λ)0.5EU◦ml-1,批号：0604201,(湛江博康海洋生物有限公司)。批号：0611092,(湛江安度斯生物有限公司)。均为0.1ml◦支-1。

细菌内毒素国家标准品,批号：981,9000EU◦支-1(中国药品生物制品检定所);细菌内毒素检查用水(简称：BET水),批号2006012,规格：10ml◦支-1,含细菌内毒素＜0.003 EU◦ml-1,(湛江博康海洋生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细菌内毒素限值(L)的确定

按公式L=K◦M-1,K为按规定的给药途径,人用每千克体重每小时可接受的最大内毒素剂量,注射剂K=5EU◦kg-1◦h-1;M为人用每千克体重每小时可接受的最大药品剂量,人均体重按60kg计算,注射时间按1h计算,灯盏细辛注射液的用法用量：静脉注射,一次20～40ml,一日 1～2次。即成人的最大剂量为 80ml,故 L=5EU◦kg-1◦h-1/80ml×60kg◦h-1,计算得 L=3.75EU◦ml-1。为了更好控制其质量,现将其细菌内毒素限值定为：L=3EU◦ml-1。

1.2.2 鲎试剂标示灵敏度的复核

按《中国药典》2010年版一部附录“鲎试剂灵敏度复核试验”项下规定进行,结果符合规定。

2 结果

2.1 供试品的干扰试验及细菌内毒素检查(凝胶法)

2.1.1 供试品的干扰预试验 由于本品L为3EU◦ml-1,采用灵敏度λ=0.5EU◦ml-1,故最大有效稀释倍数M VD=L◦C◦λ-1=25。取批号为20070136的供试品以BET水进行5、20、25倍稀释,记此稀释液系列为阴性(NPC)。另在上述稀释过程中加入标准内毒素,使每一稀释度的稀释液都含有2λ浓度的标准内毒素,记此稀释系列为阳性(PPC),进行干扰试验,结果见表1。

表1 供试品干扰预试验结果(凝胶法)

2.1.2 干扰试验 由干扰预试验结果可知,将供试品稀释25倍,对λ为 0.5EU◦ml-1的鲎试剂检查无干扰。分别取3批供试品,按《中国药典》2010年版一部进行正式干扰试验,结果见表2。由此可见,ES与 Et均在0.5λ～ 2.0λ(即0.25～ 1.0)之间,说明供试品在该浓度下不干扰试验。

表2 供试品干扰试验结果(凝胶法)

2.1.3 供试品中细菌内毒素的常规检查

将4批热原检查合格的灯盏细辛注射液用BET水稀释25倍,选用上述两种鲎试剂,依法检查细菌内毒素,结果供试品管和阴性对照管均显阴性,供试品阳性管和阳性对照管均显阳性,4批灯盏细辛注射液细菌内毒素检查结果均符合规定。

2.2 供试品的干扰试验和细菌内毒素定量检测(动态浊度法)

2.2.1 标准曲线制作及可靠性

用BET水将内毒素国家标准品进行10倍稀释,使其浓度分别为10、1、0.1、0.01 EU ◦ml-1,各取 0.2ml分别加入 0.1ml定量用鲎试剂于反应管中,混合均匀,插入仪器进行检测,每一浓度平行做4支,同时做阴性对照,检测结果见表3.

回归方程为：log T=2.852-0.2374logC r=0.9936该标准曲线线性范围为0.01～10.0 EU◦ml-1,由于阴性对照反应时间大于标准曲线最低浓度反应时间,故该标准曲线成立。

表3 标准曲线制作及可靠性(n=4)

2.2.2 最大有效稀释倍数(MVD)计算

按公式MVD=LC/λ,其中λ=0.03 EU◦ml-1,L=3 EU◦mg-1,C=4.5mg◦ml-1,计算得MVD为450。

2.2.3 干扰预试验

将供试品用BET依次稀释为 50、100、200、400倍,记为 A液;另取A液配制成含内毒素为0.5 EU◦ml-1的同样稀释倍数的供试品阳性管,记为B液;用BET水溶解定量用鲎试剂,混匀,取0.1ml分装至反应管;取A液,B液各0.2ml分别加入装有0.1ml定量用鲎试剂的反应管中,其中每个浓度2支,计算平均回收率,回收率(%)=[(B液内毒素浓度-A液内毒素浓度)/添加内毒素浓度]×100%,结果见表4。由表4结果可知,灯盏细辛注射液的100、200、400倍稀释液外加内毒素回收率均在有效范围50%～200%内,表明供试品在该试验条件下能排除干扰因素,正式干扰试验选用200倍稀释液。

表4 供试品干扰预试验结果(动态浊度法)

2.2.4 正式干扰试验[2]

将4批灯盏细辛注射液用BET水稀释至200倍,按上述干扰试验方法定量检测,计算注射液中内毒素含量和外加内毒素平均回收率,结果见表5,其中标准曲线为：

logT=2.852-0.2374logC r=0.9936由表5结果发现,4批灯盏细辛注射液200倍稀释液外加内毒素回收率均在50%～200%内,表明日常检测其内毒素含量可用200倍稀释液。

表5 供试品正式干扰试验结果(动态浊度法)(n=4)

2.2.5 定量检测

定量检测供试品和操作同上述正式干扰试验,4批供试品细菌内毒素含量均小于0.5 EU◦mg-1,结果符合规定(见表5)。

3 讨论

本文采用两种方法测定灯盏细辛注射液中细菌内毒素含量,其结果与与热原检查结果一致,且动态浊度法比凝胶法快捷,灵敏,更真实反映药品质量。结果证实灯盏细辛注射液稀释25倍(凝胶法)和200倍(动态浊度法)后对鲎试剂及内毒素反应无干扰作用。细菌内毒素检查法操作简单,准确度高,重现性好,故采用细菌内毒素定性检查与定量检测方法代替热原检查法进行质量监控合理,可行。

1 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社,2010：707.

2 邱文炜,詹云丽,刘一波,等.动态浊度法定量检测鱼腥草注射液中细菌内毒素[J].广东药学院学报,2004,20(6)：621-622.