Tau蛋白过度磷酸化诱导Aβ生成抑制THP-1细胞ABCA1的表达

邸云峰 韦丽华 焦玉蓉 王树人

(四川大学华西基础与法医学院病理生理教研室,四川 成都 610041)

阿尔茨海默尔病(Alzheimer's disease,AD)和动脉粥样硬化(AS)同属老年性疾病,年龄的增长是其发病率明显上升的共同高危因素,研究发现AD的重要致病因素β淀粉样蛋白参与AS中巨噬细胞的活化[1],而巨噬细胞的活化是AS发生、发展的重要机制。随后的一系列研究进一步显示,β淀粉样蛋白前体的生成可能是AD和AS共同的发病环节[2-4]。关于β淀粉样蛋白对AS形成的影响及其机制的研究巳涉及到多个环节,如胆固醇聚集,炎症,载脂蛋白E,血管紧张素系统,血小板,肝的X受等等[5,6]。而对于可以导致AD发生的另一重要蛋白：Tau蛋白是否对AS的形成有促进作用国内外尚甚少文献报道。本实验以参与AS病变发生的主要细胞-巨噬细胞为研究对象,探讨激活的巨噬细胞是否生成过磷酸化的 Tau蛋白,并以岗田酸刺激磷酸化Tau蛋白的生成,观察其是否对β淀粉样蛋白生成、及对胆固醇逆向转运体：三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达产生影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

人单核细胞株 T HP-1由本室保存;鼠抗人Anti-β-amyloid(1-40)(北京博奥森生物技术有限公司);兔抗人Phospho-Tau(T231)抗体与Phospho-Tau(S396)抗体(Signalway Antibody(SAB));Kadaic acid(OA)以及佛波酯(PMA)(Sigma);逆转录-多聚酶链反应试剂盒(TIANGEN公司);免疫组化试剂盒(北京中杉);总蛋白提取试剂盒(凯基公司);其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 洗涤浓缩血小板的提取

取3.8%枸橼酸钠抗凝血采血管采健康人静脉血10mL,24℃,3000r◦min-1离心12min,取上部富含血小板血浆,1300r◦min-1离心5min、洗涤(等体积无菌生理盐水),1300 r◦min-1离心 5min,离心后重悬于无血清RPM I 1640培养基中即为洗涤浓缩血小板。

1.2.2 细胞培养与分组

THP-1细胞用含 10%小牛血清 RPM I 1640培养液,37℃,5%CO2培养箱中静置培养。培养液中加青霉素和链霉素各105U◦L-1,在每次实验前用160nmol◦L-1PMA孵育THP-1单核细胞36 h,使其诱导分化成巨噬细胞。后换为无血清1640培养基。

THP-1源性巨噬细胞与洗涤浓缩血小板(108每0.5×106巨噬细胞)孵育48h,对照组不加血小板单独孵育48h[1]。将与血小板共同孵育后的细胞随机分为：对照组：不加OA;4 nmol◦L-1OA组;8 nmol◦L-1OA组;16 nmol◦L-1OA组;32nmol◦L-1OA组,继续培养24h。

1.2.3 免疫细胞化学检测定β淀粉样蛋白和过磷酸化 TAU蛋白

采用SP法对THP-1源性巨噬细胞与洗涤浓缩血小板孵育(实验组)和不加血小板单独孵育(对照组)进行免疫细胞化学染色。蛋白阳性染色以胞质出现棕黄色或棕褐色为准。选染色均匀的区域,在100倍视野下计数着色细胞占视野细胞总数的百分数(Perentage of positive cells,PP),共计数5个视野,取平均值,按着色细胞占视野细胞总数的百分比分别计1～4分：1分为＜30%,2分为30%～69%,3分为 70%～89%,4分为90%～100%。按细胞着色强弱(Staining intensity,SI)记0～3分：0分为不着色,1分为着色弱,2分为中等着色,3分为强着色。观察者单盲记分,每张切片的积分为PP×SI值,每组取5张切片。

1.2.4 蛋白免疫印迹法检测过磷酸化TAU蛋白和β淀粉样蛋白的表达

收集细胞用蛋白免疫印迹法检测过磷酸化TAU蛋白和β淀粉样蛋白。以对照组为参照,用各组的面积灰度值与对照组相比,所得的相对值作统计分析。

1.2.5 半定量逆转录聚合酶链反应检测ATP结合盒转运体A1 mRNA的表达

收集各组细胞PBS洗涤离心两次,Trizol试剂提取细胞总RNA。以细胞总RNA为模板逆转录成cDNA,以GAPDH为内对照,进行半定量逆转录聚合酶链反应。ABCA1上游引物为5'-GCTGCTGAAGCCAGGGCATGGG-3',下游引物为 5'-GTGGGGCAGTGGCCA TACTCC-3',扩增产物为 306bp;GAPDH上游引物为5'-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3',下游引物为5'-TGTCGCTGTTGA AGTCAGAG-3',扩增产物为697bp。聚合酶链反应条件：94℃温育 5min后,94℃变性1min→58℃退火1min→72℃延伸1min,共32个循环,最后一次循环72℃延伸10min;PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。用Labwork凝胶图像分析系统收集图像。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 巨噬细胞激活的形态学变化

THP-1单核细胞悬浮生长,呈圆形,如图1A。佛波酯刺激可激活、诱导THP-1向巨噬细胞分化,使细胞贴壁生长,且形态转为梭形分枝状,生出伪足等,如图1B。

2.2 巨噬细胞源性泡沫细胞过磷酸化TAU蛋白和β淀粉样蛋白的生成

TAU蛋白的两个重要磷酸化位点 TAU231(苏 aa)、TAU396(丝aa)在实验组与对照组均出现阳性染色,且实验组和对照组间无显著性差异(P＞0.05),表明THP-1源性巨噬细胞及其泡沫细胞皆能生成一定量的过磷酸化TAU蛋白。但β淀粉样蛋白在泡沫细胞内的生成量明显多于巨噬细胞(P＜0.05),见表 1、图 2。

表1 过磷酸化TAU蛋白和β淀粉样蛋白的生成(,n=5)

表1 过磷酸化TAU蛋白和β淀粉样蛋白的生成(,n=5)

＊：与对照组相比P＜0.05

组别 Phospho-Tau(T231)Phospho-Tau(S396) β-amyloid(1-40)对照组(-PLT) 7.38±1.65 7.70±1.95 1.03±0.43实验组(+PLT) 7.56±1.23 7.68±1.35 4.36±1.27＊

2.3 蛋白磷酸酶抑制剂岗田酸对TAU蛋白的过磷酸化和β淀粉样蛋白生成的影响

不同浓度OA处理THP-1源泡沫细胞24h后,Tau蛋白磷酸化修饰的免疫印迹结果见图3、4。结果显示Tau蛋白过磷酸化程度与OA量的增加呈大致的正相关量-效关系(P＜0.05),S396、T231两位点上出现明显过磷酸化。

不同浓度OA处理THP-1源泡沫细胞24h后β淀粉样蛋白的生成结果见图 5、图6。

结果显示,β淀粉样蛋白的生成与OA量的增加亦呈大致的正相关量-效关系(P＜0.05)。

2.4 岗田酸对ATP结合盒转运体ABCA1 mRNA表达的影响

随OA浓度增加,ABCA1mRNA表达呈剂量依赖的下降,恰与β淀粉样蛋白的升高成反向相关,见图7、图8。

3 讨论

Alzheimer病的两个标志性损伤为老年斑和神经原纤维缠结,前者主要系Aβ的沉积,而后者主要为过磷酸化Tau蛋白自身的异常聚集。Aβ在动脉粥样硬化斑块中的沉积已被证实,并有实验证实Aβ的沉积促进AS斑块的形成[1],但过磷酸化Tau蛋白在AS发病中的作用尚甚少文献报道。本文结果显示,蛋白磷酸酶抑制剂岗田酸对Tau蛋白的过磷酸化和Aβ的生成产生平行的促进作用,同时使胆固醇逆向转运体ABCA1的表达反向下调,提示过磷酸化Tau蛋白可能参与了AS的发病。

研究证实,蛋白磷酸酶缺陷可导致Tau蛋白过磷酸化[7]。岗田酸(Okadaic acid,OA)是从Halichondria okadai提取的蛋白磷酸酶(Protein phosphatase,PP)PP-1和PP-2A的抑制剂,能使Tau蛋白丝、苏氨酸残基位点去磷酸化[8]。本研究选择了比较具有代表性的Tau(S396),Tau(T231)两个磷酸化位点,结果表明OA抑制PP确可使 Tau蛋白两个丝、苏氨酸位点Tau(S396),Tau(T231)过磷酸化,并呈量-效关系。

Tau蛋白是一种微管相关蛋白,与细胞有丝分裂、细胞内物质转运等多种功能有关。正常情况下Tau蛋白以磷酸化和去磷酸化两种形式存在,两者处于一种平衡状态。过度磷酸化Tau蛋白生物学功能发生变化。Tau蛋白异常显示与21三体型Down氏综合征的发病有关,而Down氏综合征通常在40岁后即出现Alzheimer病,且出现淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)终身的持续高表达[9]。因此我们推测,OA诱导的Aβ增加可能继发于过磷酸化Tau蛋白的增加。

AT P结合盒转运体 ABCA1是胆固醇转运出细胞的外排泵。ABCA1基因突变所引起的一种著名的遗传性疾病被称为Tangier病,由于胆固醇外排障碍,病人全身有广泛的泡沫细胞形成,肝脾肿大,并有显著早发的 AS和冠心病[10]。ABCA1表达下调与AS的发病相关,β-淀粉样蛋白已被显示可干预胆固醇的转运[11],但目前巳报导的机制是针对清道夫受体的[5],而本文所报导的针对ABCA1的表达下调则有可能是其另一机制,目前尚未见相关报导。

本文以THP-1巨噬细胞与洗涤浓缩血小板共孵育制备泡沫细胞的依据源于Daniel M.和Guido R.Y等的研究[1,12],他们发现Aβ和APP存在于血小板,巨噬细胞吞噬血小板和Aβ是动脉粥样硬化中巨噬细胞活化的一种重要机制。本文以巨噬细胞与血小板共孵育后,Aβ亦明显增多。正常时Aβ的生成和降解保持平衡,并有一些因素保持Aβ的可溶性。Aβ的过量生成和沉积已被证实不但是AD的重要发病机制,且参与了AS的发病。本研究中,OA诱导泡沫细胞Tau蛋白过磷酸化伴随着平行的Aβ增加和ABCA1的表达下调,提示其在AS发病中也可能具有重要的作用。

综上,本文探讨了THP-1单核细胞诱导生成巨噬细胞并进一步吞噬血小板生成泡沫细胞的过程及其相关发病因素,结果显示,过磷酸化Tau蛋白和Aβ的增加可能都与胆固醇外排泵ABCA1的表达下调相关,显示过磷酸化Tau蛋白亦参与AS的发病。结合已有的文献资料,我们推测：Tau蛋白过磷酸化→Aβ增加→ABCA1表达下调→胆固醇转运障碍→AS,可能是一条Tau蛋白参与AS的发病通路。

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