五海丸质量标准研究

周燕雪 青海省药品检验所(西宁 810003)

五海丸是由陈皮、昆布、浙贝母、桔梗等 8味中药组成的大蜜丸,具有软坚、散结、理气的作用,用于瘿瘰初起。该制剂收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第八册[1],有文献报导五海丸具有抑制小鼠肺腺癌生长,肺癌细胞自主性转移和淋巴转移的作用[3]。原标准中除显微鉴别与碘化物理化鉴别外,无其他检测项目。为了更好的控制五海丸质量,本实验对其标准进行了研究,对其中的两味君药陈皮、桔梗进行了薄层鉴别,并采用高效液相色谱法测定五海丸中橙皮苷的含量[2],方法简便,专属性强,回收率好,结果准确可靠。可更好控制五海丸的质量。

1 仪器与试药 1.1 仪器 安捷伦 1100型G1314A高效液相色谱仪,SPD-10AVP紫外检测器,化学工作站(美国 Agilent公司)。

1.2 试药 陈皮对照药材(120969-200507)、桔梗对照药材(121028-200507),橙皮苷对照品(110721-200512)供含量测定用,均购自中国药品生物制品鉴定所;甲醇为色谱纯,其余试剂为分析纯,水为超纯水。薄层用硅胶 G板为青岛海洋化工厂生产。

五海丸样品与阴性药材由青海省三普药业股份有限公司提供,样品批号分别为:060413,060508,060801。

2 方法与结果 2.1 薄层鉴别 2.1.1陈皮的鉴别[2]:取本品 12g,剪碎,加硅藻土 8g,研匀,加甲醇 100mL,超声处理 30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水20mL溶解,用乙酸乙酯振摇提取 2次,每次 20mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇 1mL使溶解,作为供试品溶液[2]。同法制的缺陈皮的阴性对照溶液。另取陈皮对照药材 1g,加甲醇 20mL,同法制成对照药材溶液。再取橙皮苷对照品,加甲醇制成饱和溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法,吸取供试品溶液 10 μ L;对照药材、对照品溶液两种溶液各 4 μ L。分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-水 (10∶ 2∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以 1%三氯化铝乙醇溶液,置紫外灯(365nm)下检视,供试品色谱中,在与对照药材、对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。阴性无干扰,见图 1。

2.1.2 桔梗的鉴别[2]:取本品 18g,剪碎,加硅藻土 12g,研匀,加 7%硫酸乙醇-水(1:3)混合液 100mL,加热回流 3h,浓缩至约 20mL,放冷,用三氯甲烷振摇提取 2次,每次 20mL,合并三氯甲烷液,加水 30mL洗涤,弃去洗液,三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇 1mL使溶解,作为供试品溶液。同法制的缺桔梗的阴性对照溶液。另取桔梗对照药材1g,加 7%硫酸乙醇-水(1∶3)混合液 20m L,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法,吸取上述两种溶液各15 μL,分别点于同一硅胶 G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯(1.5∶ 1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以 10%硫酸乙醇溶液,105℃加热至显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。阴性无干扰,见图 2。

2.2 含量测定 2.2.1色谱条件与系统适用性试验:色谱柱:Agilent ECLIPEX X DB-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5um);柱温:25℃;流动相:甲醇-0.5%醋酸溶液 (45∶55);流速 1.0mL◦ min-1;检测波长:283nm。在此条件下橙皮苷与其他组分基线分离良好,橙皮苷峰理论板数为 8540。

2.2.2 对照品溶液的制备:精密称取橙皮苷对照品 11.42mg,置 50mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取上述橙皮苷对照品溶液 1m L,置10mL容量瓶中,并加甲醇稀释置刻度,摇匀即得,橙皮苷对照品溶液浓度为 0.02284mg/mL。

2.2.3 供试品溶液制备[2]:取本品 5丸,精密称定,按本品:硅藻土 (3∶ 2)比例加入已经精密称定的硅藻土,研细,混匀,取约 1g,精密称定,加入甲醇 50mL,称定重量,加热回流提取 1h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液20mL于 25mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备:除陈皮以外七味药材按供试品溶液制备项下的方法制备。在上述色谱条件下,精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各 10 μL,分别注入液相色谱仪,色谱图见图 3。橙皮苷的保留时间为 13min,橙皮苷与相邻组分达基线分离,阴性对照在此无干扰。

2.2.5 线性关系:分别精密吸取上述对照品溶液(0.02284 mg/mL)4、 10、 16、 22、 28 μL,按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积积分值(A)为纵坐标,橙皮苷进样量(X)为横坐标,回归方程为:Y=31.616X+50.579,r=1.0000。

结果表明,橙皮苷进样量在 0.09136mg～ 0.6395mg范围内线性关系良好。

2.2.6 精密度试验:精密吸取橙皮苷对照品溶液(0.02284 mg/m L)10 μL,按上述色谱条件重复进样 5次,测定峰面积,峰面积的 RSD为 1.60%。实验结果表明,在该条件下精密度良好。

2.2.7 重复性试验:取同一批样品(批号 060508)的样品 5份,按“2”项下供试品溶液的方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下,每份样品进 2针,每针10 μL,计算含量 ,结果平均含量 (n=5)为 6.66mg/粒 ,RSD为 0.67%。

2.2.8 稳定性试验:取供试品溶液 (批号060413),按上述色谱条件,分别在 0,5,10,15,24h进样 10 μL,测定峰面积,峰面积的 RSD为 0.94%。实验结果表明供试品溶液在 24h内稳定。

2.2.9 回收率试验:精密称取橙皮苷,加甲醇制成浓度为 4.016 μ g/m L对照品溶液。取已知含量的五海丸样品(批号 060508,橙皮苷含量为 6.69mg/丸)0.45g共 6份,精密称定,分别精密加入橙皮苷对照品(0.2284mg/mL)溶液 5mL,按供试品制备的方法制成供试品溶液。在上述色谱条件下,分别进样 10 μ L,进行测定,计算平均回收率,结果(n=6)为 99.13%(RSD=1.02%)。 见表 1。

表1 加样回收试验结果

2.2.10 样品测定:按上述含量测定方法,对 3批样品进行含量测定,结果见表 2。

表2 样品测定结果

3 讨 论 3.1五海丸由昆布、海藻、陈皮、槟榔、浙贝母、蛤壳(煅)、桔梗、夏枯草八味中药组成。五海丸原质量标准简单,对药品质量无法进行控制,本文建立了用薄层色谱法鉴别陈皮、桔梗,并采用高效液相色谱法测定五海丸中橙皮苷的含量,实验证明,该方法可操作性强,检测灵敏度高,结果准确可靠,重现性好,能有效地控制产品质量。

3.2 五海丸采用了甲醇索氏提取、甲醇超声提取、甲醇加热回流提取,通过以上 3种方法,不同的提取时间比较,以甲醇加热回流 1h为佳,有效成份提取完全,方法简便,便于操作,结果准确,重现性好,故选为本法的样品处理方法。

3.3 本研究同时对君药昆布、海藻也进行了含量测定的摸索[2]。①由于本品为大蜜丸,直接进行含量测定由于颜色干扰无法进行。②供试品经剪碎,400℃～500℃加热炽灼灰化,煮沸,浓缩等前处理工序,其炽灼残渣根本不灰化,均为坚韧且极难粉碎的小块状物,且在水中煮沸也不溶散,致使前处理十分困难。方法学考察表明,精密度、重复性的 RSD分别为 1.21%和 1.15%,均远远不能满足容量分析法的要求(RSD≤0.2%),且加样回收率低,说明此方法准确性差,可操作性也差。另外温度大于 560℃进行灰化,昆布、海藻中经氧化生成碘酸根离子融熔、分解,无法进行含量测定,故无法建立对昆布、海藻中碘含量测定方法。仍采用原标准对昆布、海藻中碘化物进行理化鉴别。

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准 [S].中药成方制剂 (第八册).北京.1993:37.

[2]国家药典委员会.中国药典一部 [S].北京.化学工业出版社,2005:132,146,196,208.

[3] 田 菲,贾英杰.五海丸抗 LA795小鼠肺癌腺细胞转移的研究 [J].中医药学刊 ,2002,20.(7):37-40.