星豹蛛乙酰胆碱酯酶活性测定条件的优化

马敏,张宾,李生才

(1.山西农业大学农学院,山西 太谷030801;2.山西农业大学 文理学院,山西太谷 030801)

星豹蛛(Pardosaastrigera L.Koch)是我国森林、草地、农田捕食性天敌的优势种之一。近年来,随着农药的大量使用,在杀死目标害虫的同时对天敌非靶标生物也造成了伤害。国内外有关农药对蜘蛛等天敌的杀伤力的研究已有大量报道[1～3],而国内起步较晚,近几年的研究主要集中在农药对捕食性天敌杀伤力及其捕食功能及行为的影响,发现大多数农药对蜘蛛均有很高的毒性作用,且降低了蛛体的控虫能力[4,5]。

农药在短期内还无法完全停止使用,对天敌的副作用仍将存在,如何更有效地保护星豹蛛种群成为当前亟待解决的问题之一。乙酰胆碱酯酶(AChE)是大多数农药,尤其是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标酶。AChE的测定方法虽然已很成熟,但不同来源的AChE最适测定条件会有所不同,对星豹蛛的AChE还没有详细的研究。为了系统研究星豹蛛AChE的特性,保护节肢动物,为今后对其性质进行系统全面的探索,特开展了本项研究。

1 材料与方法

1.1 供试动物来源

星豹蛛成蛛采自山西农业大学未喷施农药的杂草地,活体带回实验室禁食48 h后备用。

1.2 主要仪器与试剂

D-37520型高速冷冻离心机,Sigma公司产品、VERS Amax型酶标仪、Sartorius BS型电子天平、水浴锅。

T riton X-100,北京生物科技有限公司产品;碘化硫代乙酰胆碱(acetylthiocholine iodide,ATCh),Sigma公司产品;考马斯亮蓝G-250,Fluka公司产品;5,5'-二硫双硝基苯甲酸(5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid,DTNB);KH2PO4及Na2HPO4均为国产分析纯。

1.3 酶液制备

按表1中各项酶液浓度将新鲜星豹蛛头胸部置于匀浆器中,用不同pH值0.1 mol◦L-1磷酸缓冲液(含0.1%Triton X-100)作为提取液,在冰水浴中充分匀浆。匀浆液于4℃,15 000×g,离心20 min。取上清液作为酶源。

1.4 蛋白质含量测定

参照Bradford(1976)考马斯亮蓝G-250法[6]。

1.5 试验方法

参与星豹蛛AChE反应的5个因素列于表1。

表1 影响星豹蛛Ache反应的因素及水平Table 1 Effect of factors and their levels for acetylcholinesterase from the Cephalothorax of Pardosa astrigera

1.6 星豹蛛头胸部乙酰胆碱酯酶活性测定

由DPS系统得到 25个组合,如表 2所示,进行各组酶活性测定。取待测酶液 0.02 mL,与0.02 mL不同浓度的ATCh混匀,置于水浴锅中反应相应的时间,取出后加入 0.18 mL显色剂(DTNB)终止反应,置于酶标板上在412 nm测定光密度(OD)值。

2 结果与分析

2.1 星豹蛛头胸部AChE酶活性的测定

测得的25组星豹蛛头胸部AChE的酶活性值见表2。

表2 星豹蛛头胸部AChE不同处理组合测定的酶活性值Table 2 Application of L25(56)orthogonal experiment in assaying the AChE activity from cephalothorax of P.astrigera

2.2 星豹蛛头胸部AChE正交试验结果的极差分析

极差分析是正交试验结果直观分析的主要依据。星豹蛛头脑部AChE正交试验结果极差数据见表3。

表3 L25(56)的正交试验极差表Table 3 Analysis of the results from orthogonal projects with the methods of range analysis

根据表3中各因素的极差值R大小可以判断各因素对星豹蛛AChE酶活性影响的程度。其先后顺序依次为:pH值＞反应时间＞酶浓度＞温度＞底物浓度。其中pH值的极差最大,表明pH值是测定星豹蛛头胸部AChE酶活性时的关键性因子,影响最大,试验操作时应注意加以控制。

应用极差分析的结果,得到5因素对星豹蛛AChE酶活性最优条件的直观分析图(图1～图5)。

由图1可以看出,在试验设定的酶液浓度范围内,随着酶液的浓度的增大,AChE酶活性下降,说明酶液浓度越高会对酶活力产生抑制作用。当酶浓度为12 g◦L-1时,AChE酶活性最大。

图1 酶液浓度对酶活性的影响Fig.1 The effect of concentration on AChE activity

由图2可见,随着底物浓度的增加,星豹蛛头部AChE酶活性逐渐减小,说明过量的底物会对酶的活性产生抑制作用。当底物浓度为0.6 mmol◦L-1时,星豹蛛头胸部AChE酶活性达到最大值。

图2 底物浓度对酶活性的影响Fig.2 Effect of concentration of substrate on enzyme activity

pH过小(过酸)、过大(过碱)都能使酶蛋白变性而失活,且pH值的改变会影响酶活性中心的必须基团的解离程度,只有在特定的pH值范围内,才使酶的反应速度达到最大值。如果pH高于8.0,起终止反应的试剂DTNB就会发生自发水解[7]。由图3可见,在试验设置的体系pH值范围内,当pH达到7.0时,酶活达最大值。

图3 pH值对酶活性的影响Fig.3 Effect of pH values on enzyme activity

由图4看出,随着温度的升高,星豹蛛头胸部AChE酶活性逐渐升高,在30℃时达到最大值,随后逐渐降低。

图4 温度对酶活性的影响Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity

由图5可以看出,水浴时间过长对酶活性会产生抑制作用,水浴5 min后酶活性达到最大值。

图5 反应时间对酶活性的影响Fig.5 Effect of time on enzyme activity

2.3 正交试验结果的方差分析及多重比较

由于经F检验5个因素均达到极显著水平,故采用Duncan(新复极差法)法进行因素各水平的差异显著性检验,以便从中选出测定星豹蛛头胸部AChE酶活性的最适条件组合。结果见表4。由表4可以看出,五个因素的影响顺序与极差分析的结果相一致,5个因素对测定星豹蛛头胸部AChE的酶活性均有影响,在测定时都要加以控制。

表4 正交试验的5个影响因素各水平的差异显著性检验(SSR检验)Table 4 Multiple comparison in five factors with the method of Duncan(SSR test)

3 结论与讨论

试验结果表明,在影响星豹蛛头胸部AChE酶活性测定的5个因素中,pH值对测定星豹蛛AChE酶活性的影响最大,因此要在具体的试验中加以控制。同时,测定AChE酶活性(Ellman法)需限制在一定的pH值范围内。在碱性条件下,大多数有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂易分解,所以使用的缓冲液的 pH值不宜过高,以 7.0～7.6为宜[8]。温度对酶活性的影响很大,既能使酶反应速度加快,也能使酶变性而影响酶促反应速度。不同的酶或不同来源的同一种酶,其反应的最适温度可能是不同的,如哺乳动物的AChE最适温度通常在37℃,鸟类42℃,昆虫中家蝇是30℃[9]。本试验酶液浓度和底物浓度对酶活性的影响均是由高到底的变化趋势,说明以一头星豹蛛为研究对象时,此条件下酶活性最大,且易于试验操作。但是对于测定同属于狼蛛科的拟环纹豹蛛AChE活性时所用的底物浓度0.8 mmol◦L-1[10]对星豹蛛不适用。为了更加准确迅速测定酶的酶活性,有必要确定最适反应时间。通过正交试验确定了测定星豹蛛头胸部AChE活性是的最佳组合条件:酶浓度12 g◦L-1;底物浓度为0.6 mmol◦L-1;反应体系pH值为7.0;反应温度为30℃;反应时间为5 min。

通过本试验可以看出,正交试验作为多因素分析的一种设计,可以通过部分实施了解全面试验情况,从中找出较优的处理组合,大大节省人、财、物力和时间,使一些难以实施的多因素实验得到实施,此方法可以很好地简化试验[11]。本试验选用的星豹蛛是北方夏季的成蛛,这个时期是农田施药的高峰期,研究这时期的星豹蛛,可以更好的为保护它提供有利的理论依据。同一生物不同时期AChE分子大小、形状、溶解性等理化性质存在差别[12]。有些昆虫AChE活性随着龄期增加而增加[12],有些昆虫AChE活性随着龄期增加而减弱[13]。而对于星豹蛛体内AChE的活性的最适反应条件是否会随季节、昼夜节律及龄期的不同而变化,仍有待于进一步研究。

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