补肾活血法对肾阳虚大鼠内耳细胞Caspase-3凋亡影响的实验研究

李 莉，王俊锋，熊大经

（1.山西中医学院，山西 太原 030024； 2.成都中医药大学耳鼻喉科教研室，四川 成都 610075）

耳聋是耳鼻咽喉科的常见病之一。近年来的临床调查表明，明显听力障碍者约占世界总人口的7%～10%［1］，耳聋已成为影响人类生活质量的最主要问题之一。中医基础理论认为，“肾主骨，在窍为耳”，“肾气通于耳，肾和则耳能闻五音亦”（《灵枢·脉度篇》），耳司听觉从属于肾，肾气足则听觉聪敏，肾虚则耳鸣耳聋。现代研究已表明中医肾与耳在醛固酮、甲状腺素、微量元素等方面存在着密切的联系，但鲜见从更深的层次细胞凋亡来探讨二者的关系。基于此，本实验采用补肾活血法来观察肾阳虚大鼠内耳毛细胞的凋亡情况并探讨其作用机制，从而为中医肾与耳的关系提供新的实验资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 用耳廓反应灵敏的健康SD大鼠30 只，体重（220±20）g，雌雄各半（由四川大学实验动物中心提供，合格证号：24101113），饲养于成都中医药大学附属医院药理实验中心，室内温度控制在20℃～25℃。

1.1.2 主要试剂及仪器 醋酸强的松龙注射液由浙江仙琚制药股份有限公司生产（批号：021225）。Cap－sase-3试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供（批号：BAO0588）。主要仪器有MEB-2208肌电图/诱发电位仪、FJ-2008pr自动计数仪等，cAMP、cGMP放射免疫测定箱均购自上海中医药大学同位素室。

1.1.3 实验药物 补肾活血方由山茱萸、熟地、山药、枸杞子、红花、水蛭等10味药组成，按比例煎成浓度为1.458 g/mL的溶液，由成都中医药大学附属医院制剂室制备。

1.2 实验方法

1.2.1 造模与分组 自由喂养1 w后，按体重、雌雄随机选取10只用作空白对照组，其余20只造模。造模方法如下：先将醋酸强的松龙注射液125 mg/5mL用生理盐水稀释为5 mg/mL，按0.8 mg/100 g量后腿肌肉注射，每天1次，连续10 d。将造模后大鼠随机分成模型组、中药组，每组10只。

1.2.2 各组用药及处理 造模后，空白对照组与模型组每天灌胃10 mL/kg的生理盐水，中药组每天灌胃14.58 g生药/kg的补肾活血中药复方（1.458 g生药/mL）。每日灌胃1次，连续给药2 w。

1.2.3 观察指标

1.2.3.1 一般情况观察 实验期间观察大鼠的反应、活动情况、进食量、毛色、大小便等，隔日称体重。

1.2.3.2 测定环磷酸腺苷 （cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）含量 采用放射免疫法，采血用0.5 mol/L EDTA（pH 7.5）生理盐水溶液抗凝，用量为血液体积的1%。取股动脉血，摇匀放入冰浴中，1 h内离心10 min（2000转/min），取出血浆置于－15℃～－20℃保存，严禁反复冻融。然后严格按照说明书进行操作。

1.2.3.3 听性脑干反应（ABR） 以美国Larson Davis公司生产的声级计，校准日本NIHON KONDEN公司生产的MEB-2208肌电图/诱发电位仪检测。大鼠腹腔注射盐酸氯胺酮注射液（剂量为5 mg/100 g按大鼠实际体重计算，必要时用一般剂量重复一次）进行麻醉。记录针电极插入颅中线前囟皮下，参考电极和地线分别置于左侧和右侧耳后皮下。YE-102J型耳塞插入耳廓内距鼓膜1 cm处并保持密闭，左耳分别以10 Hz和50 Hz刺激率、80 dB SPL疏密交替极性短声刺激，右耳以50 dB SPL白噪声掩蔽，记录通频带 1 Hz～3 KHz，灵敏度 10 μV/格（μV/D），分析时间1 ms/格（ms/D），叠加200次记录ABR。每次重复测试3次观察重复性，以潜伏期最短、幅度最高的波型为准，并记录ABR阈值。

1.2.3.4 耳蜗HE染色 处死动物后，迅速取出听泡，用4%多聚甲醛固定液固定48 h，10%的EDTA脱钙1 w后，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，平行于蜗轴方向切片。切片4 μm，HE染色。

1.2.3.5 耳蜗切片Caspase-3染色 严格按照说明书进行操作，在显微镜下观察Caspase-3染色情况。

1.3 统计学方法

每组均随机选取6只大鼠测试指标并纳入统计。SPSS11.0统计软件进行分析。

2 结 果

2.1 动物的一般情况

造模过程中实验大鼠逐渐出现饮食减少，体温下降，蜷缩懒动、倦怠，畏寒喜暖，反应迟钝，毛发失去光泽，体重增长缓慢等不良反应。用药后，实验大鼠饮食逐渐增加，毛发逐渐恢复光泽，脱毛现象逐渐减少，精神好转，体重增加明显。空白对照组未见明显异常。给药2 w后各组大鼠体重比较，结果见表1。

表1 给药2 w后各组大鼠体重比较 （g，±s）

表1 给药2 w后各组大鼠体重比较 （g，±s）

注：与空白对照组比较，1）P<0.01；与模型组比较，2）P<0.01

组别 n 体重空白对照组 6 244.9583±2.79129模型组 6 226.0517±3.414731）中药组 6 243.4833±4.967922）

由表1可以看出，模型组大鼠体重显著低于空白对照组（P<0.01），而中药组与空白对照组大鼠体重比较差异无统计学意义（P>0.05），中药组大鼠体重较模型组显著增加（P<0.01）。

2.2 给药后各组大鼠血浆cAMP、cGMP含量及其cAMP/cGMP比值比较

结果见表2。

表2 用药2 w后各组大鼠血浆cAMP、cGMP含量及其比值比较 （±s）

表2 用药2 w后各组大鼠血浆cAMP、cGMP含量及其比值比较 （±s）

注：与空白对照组比较，1）P<0.01；与模型组比较，2）P<0.01

组别 n cAMP（fM/mL） cGMP（fM/mL） cAMP/cGMP空白对照组 6167.8967±14.6604 229.6850±14.52520.7300±0.4850模型组 6 49.5450±12.68141） 324.6183±37.07071）0.1802±0.55011）中药组 6200.3417±14.25452） 287.3177±15.07010.6957±0.25092）

由表2可以看出，模型组大鼠血浆cAMP含量显著低于空白对照组（P<0.01），中药组与空白对照组大鼠血浆cAMP含量比较差异无统计学意义（P>0.05），中药组大鼠血浆cAMP含量较模型组显著升高（P<0.01）。与空白对照组比较，模型组大鼠血浆cGMP含量显著增高（P<0.01），中药组与空白对照组cGMP含量比较差异无统计学意义（P>0.05）；模型组大鼠cAMP/cGMP比值显著低于空白对照组（P<0.01），中药组与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），中药组cAMP/cGMP比值与模型组相比显著增高（P<0.01）。

2.3 给药后各组大鼠ABR阈值比较

结果见表3。

表3 用药2 w后各组大鼠ABR阈值比较 （dB SPL，±s）

表3 用药2 w后各组大鼠ABR阈值比较 （dB SPL，±s）

注：与空白对照组比较，1）P<0.01；与模型组比较，2）P<0.01

组别 n ABR阈值空白对照组 6 4.59833±0.231379模型组 6 7.29583±0.5169191）中药组 6 4.71867±0.3633732）

由表3可以看出，模型组大鼠ABR阈值较空白对照组显著升高（P<0.01），中药组大鼠ABR阈值较空白对照组升高，但差异比较无统计学意义（P>0.05）。中药组ABR阈值与模型组比较显著降低（P<0.01）。

2.4 给药后各组大鼠耳蜗切片HE染色情况比较

各组大鼠耳蜗切片都未见蜗神经及螺旋神经节细胞变性，血管纹处清晰，Corti器处也无炎细胞浸润。但Corti器毛细胞数目各组之间有着明显的变化。空白对照组Corti器毛细胞数目正常，未见缺损；模型组Corti器毛细胞数目较正常明显减少；中药组Corti器毛细胞数目大多正常或全在，仅有少部分丧失1个左右。结果见图1～图3，表4。

表4 给药2 w后各组大鼠耳蜗残存毛细胞计数比较 （个，±s）

表4 给药2 w后各组大鼠耳蜗残存毛细胞计数比较 （个，±s）

注：与空白对照组比较，1）P<0.01；与模型组比较，2）P<0.01

组别 n 毛细胞计数空白对照组 6 16.65±4.34模型组 6 9.79±4.341）中药组 6 15.21±4.192）

2.5 用药后各组大鼠耳蜗切片免疫组化情况比较

模型组大鼠耳蜗组织切片Caspase-3免疫组化染色呈强阳性，颜色呈棕黄色，染色范围超过一半，Corti器上毛细胞普遍发生凋亡。空白对照组耳蜗组织切片Caspase-3免疫组化染色浅，比阴性略强，染色范围较小，Corti器上毛细胞仅有极少部分凋亡阳性染色，多数无凋亡发生。中药组免疫组化染色呈不典型弱阳性，染色较浅，而且大多数毛细胞无凋亡发生。结果见图4～图6，表5。

表5 给药2 w后各组大鼠耳蜗切片Corti器免疫组化染色阳性强度情况

3 讨 论

图1 空白对照组大鼠耳蜗HE×400

图2 模型组大鼠耳蜗HE×400

图3 中药组大鼠耳蜗HE×400

图4 空白对照组大鼠耳蜗Caspase-3染色

图5 模型组大鼠耳蜗Caspase－3染色

图6 中药组大鼠耳蜗Caspase－3染色

3.1 肾阳虚动物模型的评价

合理的动物模型是开展医学研究的关键环节，肾阳虚动物模型的研究至今已有几十年的历史，取得了长足的进展。目前常用的方法有皮质激素造模法、抑制甲状腺功能法、抑制DNA合成等法。而皮质激素造模法是应用最广泛的造模方法，该方法经过多方面的验证，已成为应用较多且较公认的肾阳虚模型之一。我们在实验中观察到，大鼠在肌肉注射醋酸强的松龙注射液后，出现了饮食减少，体温下降，蜷缩懒动、倦怠，畏寒喜暖，反应迟钝，毛发失去光泽，体重增长缓慢等不良反应，符合肾阳虚的临床特征，而且血浆中cAMP含量降低，cGMP含量升高，cAMP/cGMP比值降低，也进一步支持肾阳虚模型，这也是公认的肾阳虚证的特异性病理变化之一［2］。

3.2 补肾活血法对肾阳虚大鼠听力的影响

ABR是Jewett在1970年利用电子计算机技术描记成功并命名的一种均和诱发电反应。它可无损伤地描记不到1 μV的极小的生物电位。目前ABR在听觉诱发电位中是应用最广泛、发展最快的一项技术。ABR为突触后电位，在一定刺激强度下相当稳定，其两耳间几乎无差别，个体间和性别间差异均在0.2 ms以内，而且镇静药、麻醉药等对ABR皆无影响。因此ABR各波潜伏期是良好的观测指标。ABR的临床应用主要有：①了解听阈情况；②了解听神经至外侧丘系处的神经功能是否完整，即确定病变部位［3］。由此我们可通过检测ABR来客观了解中药治疗后大鼠的听力情况。

本实验结果表明，肾阳虚大鼠ABR反应阈升高，中药组可降低ABR反应阈，说明补肾活血法具有改善肾阳虚大鼠听力的作用。中药复方可能通过整体的调节改善内耳的听觉通路传导，或直接促进内耳细胞功能活动，从而提高耳蜗感音功能。其中方中的黄芪、山茱萸、怀山药、五味子等均有增强机体免疫的作用，而且黄芪还有促使Na＋、K＋、ATP酶的活性增高，保护内耳毛细胞，改善听力的作用。

3.3 补肾活血法对抗肾阳虚大鼠内耳细胞Capsase－3 的凋亡

凋亡是一高度可调控的生理过程，它在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟以及维持正常组织和器官的细胞数目恒定与生长平衡、人体衰老及疾病发生等方面都起着重要作用。在细胞凋亡的分子生物学的研究中，许多蛋白酶尤其是蛋白酶同源物的发现，使蛋白酶在细胞凋亡中的重要地位越来越被人所关注［4］。目前已发现一类并且已成为研究热点的是Caspase家族。目前已发现该蛋白酶家族成员至少有14个，其中最关键的是Caspase-3。本实验中模型组大鼠的耳蜗Corti器毛细胞普遍发生凋亡，染色呈强阳性且较深，中药组仅部分细胞凋亡呈弱阳性染色且较浅，说明中药复方在肾阳虚所诱发的耳蜗毛细胞凋亡发生的早期，能够对抗其凋亡的发生。许多活血化瘀中药作为氧自由基的清除剂，通过对氧离子的清除作用，能对抗耳蜗损害时产生的脂质过氧化反应［5］，有效保护细胞膜的结构和功能，缓解细胞凋亡发生。现代药理研究表明，补肾活血方中山茱萸能够抑制血小板聚集，降低血黏度，抑制脂质过氧化的作用。五味子能改善神经系统的功能，可加强调节肾脏小动脉的能量代谢，延缓衰老。红花、水蛭能改善耳蜗微循环，抗血栓形成的作用。其中黄芪、五味子还可诱导IL-2、INF的产生，从而诱导细胞凋亡的发生［6］。中药复方能诱导细胞发生凋亡，有效减轻或阻止疾病的发展，可能与黄芪、熟地、五味子等药物的细胞因子调节作用有关，还可能与红花、水蛭等具有清除氧自由基的作用有关。

［1］田勇泉.耳鼻咽喉科学［M］.5版.北京：人民卫生出版社，2001.

［2］陈英华，欧阳轶强，宋琪，等.肾阳虚证动物模型规范化研究中诊断指标选择的初步探讨［J］.中国中医基础医学杂志，2003，9（10）：26-30.

［3］黄选兆，汪吉宝.实用耳鼻咽喉科学［M］.北京：人民卫生出版社，1998.

［4］汤亚南，赵风临，叶鸿瑁.新生大鼠缺氧缺血后海马Caspase-3 mRNA的表达及硫酸镁的神经保护机制研究［J］.中华儿科杂志，2003，4（3）：212-214.

［5］巴云鹏，董明敏，董民声，等.复方丹参片抗耳蜗外毛细胞凋亡的实验研究 ［J］. 中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2001，9（3）：105-107.

［6］李学军，杨叔禹.中医药促进细胞凋亡机理研究进展［J］.中国中医基础医学杂志，2003，9（1）：73-74.