石榴皮多酚的提取及其对人宫颈癌He La细胞作用的研究

杨 滨,李婉萍,娄晓明,姜 囡,姜丽红

(1中国医科大学附属盛京医院,沈阳 110004；2解放军 463医院)

石榴皮是石榴科植物石榴的干燥果皮,性酸、味涩,具有涩肠、止血、杀虫的功效。现代药理学研究表明,石榴皮具有抗病毒、抗菌、抗氧化和抗肿瘤等作用,从其当中提取的多酚具有很强的抗肿瘤活性[1,2]。石榴皮多酚的提取及提取物的抗氧化、抑菌作用已有报道[3,4],而对石榴皮多酚提取物的抗肿瘤活性研究较少。2008年 4月 ～2009年 7月,本研究探讨了石榴皮多酚的提取及其对人宫颈癌 He-La细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Folin-Denis试剂(100 g钨酸钠、20 g磷钼酸、50 ml 85%磷酸和 750 ml蒸馏水混合,沸水浴中回流 2 h,冷却后定容至 1 L)。苏木素配制:苏木精 0.4 g溶于 50 ml无水乙醇,硫酸铝 2 g溶于150 ml蒸馏水,二者混匀,加热至沸腾,加入碘酸钠0.1 g和柠檬酸 0.2 g。没食子酸 (色谱纯)(TREECHEM标准品系列)及各种有机溶剂(分析纯)均购自沈阳新兴试剂厂；HeLa细胞株购自中科院,由本实验室传代保存。

1.2 方法

1.2.1 石榴皮多酚提取方法优化 石榴皮 40℃烘干,研磨成粉末后按下述方法进行多酚提取。①浸提法:取 20 g石榴皮粉末,以 20%(体积分数)乙醇作溶剂,料液比(g∶ml)1∶20,温度 50 ℃,提取时间 1 h。②索氏回流法:取 20 g石榴皮粉末置于索氏提取器中,20%乙醇水溶液 400 ml于 80℃回流 2 h。③微波法:将 20 g石榴皮干粉浸于 400 ml 20%乙醇水溶液中,置于实验用微波炉中加热 2 min,反复 3次。处理后的样品均用布氏漏斗抽虑,将滤液真空旋转蒸发至小体积后定容为 30 ml,加 40 ml甲醇、80 ml氯仿,萃取5 h。取上层非脂质部分,真空旋转蒸发,0.45μm水膜过滤,定容至 5 ml。

1.2.2 多酚含量的测定 总多酚含量的测定采用Folin-Denis法,以没食子酸作为标准品,对石榴皮中总多酚做定量分析:①绘制多酚含量标准曲线:称取0.05 g没食子酸,配制成 0.1 mg/ml的水溶液；分别取 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/ml 6个浓度梯度,每个浓度设 3个平行管,加入 2.5 ml Folin-Denis试剂,反应 5 min后加 2 ml 75 g/L的碳酸钠溶液,用蒸馏水定容至 10 ml后 50℃水浴 5 min,冷却 2 h后以蒸馏水调零。以没食子酸为标准对照,对其进行全波长扫描,在 760 nm处有特征吸收峰,以该波长作为测定波长。②不同方法提取石榴皮多酚含量测定:从各方法制备的样品中精确吸取 0.5 ml石榴皮多酚粗提液,每个样品做 3个平行,按照上述方法测定提取物多酚的含量。

1.2.3 粗提物抗肿瘤活性测定 将 HeLa细胞培养于含 10%小牛血清的 RPMI-1640培养液中,置 37℃、5%CO2培养箱中传代培养。

1.2.3.1 MTT法检测多酚粗提物对 HeLa细胞增殖的影响 分别将 3种提取物的粗提液浓缩后用 2 ml PBS溶出,过滤除菌,稀释为不同浓度。将 HeLa细胞以每孔 200μl接种于 96孔培养板中,细胞密度为每孔 104个,培养 12 h,使其充分贴壁,然后换液为无血清的 RPMI-1640培养,24 h后换液为含浓度分别为 0、10、20、40、80、160、320 μg/ml多酚粗提物的无血清 RPMI-1640培养液培养,每个浓度设 3个复孔,CO2培养箱中孵育 24 h。每孔加入 5 mg/ml MTT 20μl,继续放入 5%的 CO2培养箱中染色 4 h,吸去上清,加入 200μl DMSO溶解细胞内形成的结晶,用酶标仪测定波长 490 nm处的吸光度(OD)值,计算粗提物对 HeLa细胞的抑制率。抑制率(%)=(空白孔 OD值 -实验孔 OD值)/空白孔 OD值×100%

1.2.3.2 Transwell法检测多酚粗提物对 Hela细胞的侵袭抑制作用 包被基底膜(铺胶):冰上操作,按体积比 1∶7稀释过夜解冻的 Matrigel,充分混匀后按每小室 100μl铺胶至 Transwell小室内部的膜上,置 37℃培育 3 h。将 Transwell小室放入 24孔板中,下室加入含 10%血清的 RPMI-1640培养液 500 μl,取细胞悬液 100μl加入上室,细胞数为 1×105/孔,在上室加入多酚粗提物至终浓度为 0、10、20、40、80、160、320 μg/ml,每个样本重复 3次,37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养 24 h,取出 Transwell小室,PBS轻轻冲洗,上下各冲洗 1次,用棉签擦去微孔膜上层的细胞,甲醇室温下固定 15 min,苏木素染液染色 40 min后蒸馏水冲洗。用倒置显微镜(200×)对侵袭转移至微孔膜下层的细胞计数。每个样本选取 5个视野计数细胞,取其均数。抑制率(%)=(空白孔细胞数 -实验孔细胞数)/空白孔细胞数 ×100%。

1.2.4 统计学方法 采用 SPSS 10.0软件进行统计分析,数据以±s表示,组间比较采用t检验。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 提取效率结果 没食子酸在 0～0.10 mg/ml的浓度范围内与其 OD值呈良好线性关系。浸提法、索氏提取法、微波提取法提取的多酚含量分别为(17.30±0.01)、(16.62±0.02)、(23.08±0.01)g/100 g。

2.2 多酚粗提物对 HeLa细胞增殖的影响 低浓度多酚粗提物(10μg/ml)对 HeLa细胞的增殖抑制作用并不明显(P＞0.05),但随着浓度升高抑制作用逐渐增强,40μg/ml的多酚粗提物对 HeLa细胞增殖有明确的抑制作用(P＜0.05),多酚粗提物对HeLa细胞增殖抑制的半数抑制浓度 (IC50)为78.13 μg/ml。

2.3 多酚粗提物对 HeLa细胞侵袭的影响 0、10、20、40、80、160、320 μg/ml的多酚粗提物导致 HeLa细胞迁移的个数分别为 234、162、110、58、45、32、24个,抑制率分别为 0、30.73%、52.92%、75.25%、80.94%、86.20%、89.76%,由此可见,随着多酚粗提物浓度的增加,HeLa细胞侵袭转移数减少,细胞迁移能力下降。

3 讨论

微波提取法具有高效性、强选择性、操作简便、产率高、副产物少、产物易于纯化等特点[5],故微波法提取多酚类活性物质已被广泛应用。本实验通过对石榴皮多酚提取率进行系统研究,进一步验证了微波提取法较浸提法、索氏回流法更具优势。

近年来众多学者发现多酚具有很强的抗癌活性,其中对于茶多酚的研究最为深入。通过大量的流行病学调查和实验研究证实,茶多酚不仅有化学防癌的作用,还可以直接杀伤癌细胞[6]。其中最为典型的多酚类化合物是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),它可使 PC-9细胞生长阻滞在 G2/M期,诱导 Molt B细胞凋亡,抑制肿瘤细胞浸润转移,并且具有强烈的和直接的抑制端粒酶的作用[7]。本实验证实石榴皮多酚对宫颈癌 HeLa细胞的增殖和侵袭具有抑制作用,且效果显著,该结果为石榴皮多酚作为抗肿瘤药物提供了一定的理论依据。

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[3]李建科,李国秀,赵艳红,等.石榴皮多酚组成分析及其抗氧化活性[J].中国农业科学,2009,42(11):4035-4041.

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[5]付为琳,杨立刚,孙桂菊.微波萃取在菊花黄酮提取工艺中的应用研究[J].食品研究与开发,2008,29(1):1-3.

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