MMP-2靶向 RNAi质粒的构建及其对小鼠巨噬细胞 MMP-2表达的沉默作用

王 政,李为民,周宏艳,郭虹凤,孙文学

(哈尔滨医科大学第一临床医学院,哈尔滨 150001)

RNA干扰(RNAi)是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制,是指内源性或外源性与靶基因的转录产物 mRNA存在同源互补序列的双链 RNA(dsRNA),在细胞内特异地降解该mRNA,是一种序列特异性的转录后基因沉默(PTGS)[1]。 RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特异性强等优点[2]。肺间质纤维化是一种进行性加重的弥漫性肺疾病,可造成肺结构与功能不可逆损伤[3]。近年发现,基质金属蛋白酶(MMPs)在肺纤维化的发生发展中起重要作用[4]。2009年 9～11月,我们设计了能转录小发卡结构 RNA(shRNA)的DNA序列,并与 psiSTRIKETM质粒载体连接,构建受控于人 RNA聚合酶Ⅲ启动子 U6的真核表达载体,以脂质体法将重组质粒导入小鼠巨噬细胞内,观察该质粒对小鼠巨噬细胞 MMP-2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 psiSTRIKETMU6载体,小鼠巨噬细胞系RAW264.7,限制性内切酶 Pst I,质粒小量提取试剂盒,凝胶回收试剂盒,LipofectamneTM2000转染试剂,总 RNA提取试剂盒,cDNA反转录试剂盒,RPMI-1640培养基,山羊抗鼠 MMP-2抗体,FITC-兔抗山羊IgG。

1.2 方法

1.2.1 MMP-2特异性 siRNA的设计 从 GenBank中选取小鼠MMP-2基因序列,采用 siRNA Target Designer-Version 1.51设计软件设计 2对 MMP-2基因发卡寡核苷酸,序列符合 siRNA表达载体 psiSTRIKETMU6的要求。DNA序列片断由上海生工公司合成。

1.2.2 MMP-2 siRNA表达载体的构建 1μg/μl人工合成单链核苷酸在退火缓冲液中,90℃ 3 min后缓慢降到室温。与 5μl快速连接缓冲液、1μl psiSTRIKETM载体(50 ng/μl)、2 μl Nuclease-Free水和 1μl T4 DNA连接酶(3 U/μl)配制成连接反应液,室温培养 1 h。加入 100μl E.coli JM109感受态细胞中,冰浴。加入 400μl室温的 LB培养液,37℃振荡培养(50 r/min)45 min。200μl转化液涂在LB/氨苄西林平板上铺板,37℃过夜培养。挑取菌落,小量提取质粒,经 pst I酶切鉴定正确的重组质粒命名为 psiSTRIKETM-MMP-2,-20℃保存。

1.2.3 psiSTRIKETM-MMP-2基因转染 将RAW264.7细胞接种于 6孔板,置于 37℃、5%CO2培养箱中,待细胞生长融合达 90%时,采用 LipofectamneTM2000转染试剂进行转染。实验分为实验组、阴性对照组和空白对照组。实验组每孔分别加入 4 μl脂质体和 psiSTRIKETM/MMP-2重组质粒 2μg,阴性对照组加 LipofectamneTM2000转染试剂和 siSTRIKETMU6质粒 2μg,空白对照组则不加任何干扰因素。分别于转染前、转染后 24、48、72 h收获细胞检测 MMP-2的表达水平。

1.2.4 RAW264.7细胞 MMP-2 mRNA检测方法采用 RT-PCR法。应用 Trizol试剂盒提取细胞总RNA,用逆转录试剂盒进行逆转录合成 cDNA。以β-actin为内对照,RT-PCR扩增 MMP-2目的基因。产物经含 0.5 mg/L溴化乙啶的 1.5%琼脂糖凝胶电泳分析结果,重复 3次。凝胶扫描系统分析处理,以 MMP-2 mRNA与 β-actin mRNA的灰度比值作为MMP-2 mRNA的表达量。

1.2.5 RAW264.7细胞 MMP-2蛋白检测方法 采用 Western blot法,按试剂盒说明书操作,重复 3次,以凝胶扫描系统 Labworks软件计算灰度值。

1.2.6 统计学方法 采用 SPSS13.0软件分析。组内比较和组间比较用方差分析及 t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 psiSTRIKETM-MMP-2重组质粒的鉴定结果psiSTRIKETM载体包含一个 PstⅠ位点,重组质粒将会形成第 2个 PstⅠ位点。经限制性 PstⅠ内切酶消化后,成功的重组质粒将产生 2个 DNA片断。重组质粒 psiSTRIKETM-MMP-2用限制性 PstⅠ内切酶酶切后,琼脂糖凝胶电泳中可清楚地看到重组载体被切为 2个片断,证明重组质粒构建成功。

2.2 各组细胞 MMP-2 mRNA表达比较 阴性对照组 MMP-2 mRNA表达量为 1.326±0.052,空白对照组为 1.257±0.067,实验组转染 24、48、72 h时分别为 0.713±0.075、0.334±0.059、0.192±0.041,与阴性对照组、空白对照组比较,P均 ＜0.01。

2.3 各组细胞 MMP-2蛋白表达比较 阴性对照组MMP-2蛋白表达量为 185.90±22.72,空白对照组为 182.90±22.72,实验组转染 24、48、72 h时分别为 142.66±18.24、53.04±9.86、39.41±5.63,与阴性对照组、空白对照组比较,P均 ＜0.01。

3 讨论

肺纤维化是多种原因引起的以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质(ECM)聚集为特征的疾病。其病理特点是长期慢性肺部炎症及肺泡持续性损伤,反复破坏、修复、重构和胶原过度沉积,肺实质广泛重塑。肺纤维化的发生是一个复杂的过程,过去认为肺纤维化都是肺部炎症损伤的结局。现研究发现,其发病机制涉及多种生长因子,包括 MMPs、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子、成纤维生长因子、血管内皮生长因子等。其中,MMPs尤其是 MMP-2起关键作用[5]。MMPs是一类对细胞外基质具有降解活性的蛋白酶超家族。其在中性 pH条件下,依赖 Ca2+和 Zn2+为辅助因子而激活,可以降解所有 ECM成分。近年发现,肺泡上皮细胞破坏与基底膜损伤是肺间质性纤维化病变早期的特点。MMPs与细胞因子、生长因子之间以一个十分复杂的网络联系,参与肺间质纤维化的发生发展。肺泡巨噬细胞分泌 MMPs,主要包括 MMP-2、MMP-9等。它们都以酶原的形式被分泌,通过一系列的酶切作用被激活,都可以降解Ⅳ型胶原。其中,MMP-2与细胞因子、生长因子之间的相互激活,通过对 ECM的降解,链接了炎症细胞与肺结构细胞之间的信息交流,介导了肺泡炎症与进行性肺间质纤维化的进程[6,7]。RNAi是用由 dsRNA前体剪切产生的短的反义 RNA靶定对应的 mRNA,然后进行剪切,促使 mRNA降解。RNAi可以高效、特异的阻断体内特定基因的表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,是基因沉默的理想工具,可直接抑制疾病相关基因,从而达到治疗或预防疾病的目的[3,4]。

本研究成功克隆了靶向小鼠巨噬细胞 MMP-2的重组质粒。体外实验表明,psiSTRIKETM-MMP-2重组质粒能明显下调小鼠巨噬细胞 MMP-2 mRNA和蛋白的表达,且 MMP-2 mRNA和蛋白表达的抑制率相对一致,说明 MMP-2表达的抑制位点在蛋白质翻译过程之前,这也符合 RNAi转录后基因沉默的作用机制。本研究结果说明,psiSTRIKETM-MMP-2 RNA干扰质粒能够特异、高效地抑制巨噬细胞 MMP-2的表达,提示通过 RNAi降低巨噬细胞中MMP-2表达,可能减少肺脏细胞外基质的降解,从而防止肺纤维化的进展。但肺纤维化是一个长期而又复杂的过程,其中有很多机制我们尚未完全了解,还需要进一步研究。

[1]Mello CC,Conte DJr.Revealing the world of RNA interference[J].Nature,2004,431(5):338-342.

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[3]Mert H,Yoruk I,Ertekin A,et al.Vitamin levels in lung tissueof rats with bleomycin induced pulmonary fibrosis[J].J Nutr Sci Vitaminol(Tokyo),2009,55(7):186-190.

[4]García-Alvarez J,Ramirez R,Sampieri CL,et al.Membrane type-matrixmetalloproteinases in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis,2006,23(1):13-21.

[5]Radisky DC,Przybylo JA.Matrix metalloproteinase-induced fibrosis and malignancy in breast and lung[J].Proc Am Thorac Soc,2008,5(3):316-322.

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