离子通道相关蛋白FXYD6功能区的原核表达及纯化

陈雄飞，周宁新

(1辽宁医学院，辽宁 锦州 121001;2中国人民解放军第二炮兵总医院)

苯丙氨酸-X-酪氨酸—天冬氨酸(FXYD)基因家族蛋白是一类小分子的单跨膜蛋白，有离子通道或离子通道调节作用，和Na+-K+-ATP酶的结构功能密切相关。FXYD6蛋白是FXYD家族新成员，近期研究显示其与精神病易感性、内耳听神经平衡功能及肿瘤等有关。2010年4月，我们对FXYD6功能区(FXYD6-ex)进行了原核表达及纯化，旨进一步研究FXYD6蛋白的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①载体和菌种:克隆质粒载体PMD18-T Simple、XhoⅠ和ECORⅠ酶切后的表达质粒载体pET28a(中国科学院生物物理所阎锡蕴教授惠赠)、克隆菌株Trans 10感受态细胞、表达菌株大肠杆菌Rossetta。②主要试剂:全长FXYD6cDNA序列，XhoⅠ、ECORⅠ限制性内切酶，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，质粒抽提试剂盒，His-Tag单克隆抗体，高灵敏度化学发光检测试剂盒，LB培养基。

1.2 FXYD6-ex目的基因扩增和纯化 采用SignalP 3.0软件进行FXYD6蛋白预测，前18个氨基酸为信号肽。用全长FXYD6cDNA序列扩增除信号肽外的功能区FXYD6-ex，利用Primer 5.0引物设计软件，设计一对PCR引物，并在每条引物的5＇端引入限制性内切酶识别序列。上游引物:5＇-GAATTCAGTGCAGCTGTGAAAAGGAG-3＇，5＇末端含有限制性内切酶ECORI的切割位点;下游引物:5＇-CTCGAGTCAGTTCTCTGCTTTCTGG-3＇，5＇末端含有限制性内切酶XhoI的切割位点;引物合成由英骏生物技术有限公司完成，测序由北京博尚生物技术有限公司完成。PCR扩增条件:95℃预变性5 min，变性—退火—延伸的反应循环为95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，共36个循环，72℃延伸10 min，将 PCR产物行琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察，胶回收试剂盒回收目的片段。

1.3 表达质粒构建及鉴定 将1.2目的回收片段与pMD18-T Simple载体连接，并转入克隆载体大肠杆菌Trans10中进行质粒扩增，以质粒抽提试剂盒提取质粒并用Xhol、ECORI双酶切，琼脂糖凝胶上样电泳，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。将纯化的酶切产物与已酶切的pET-28a(+)载体连接，转入表达载体Rossetta中，两次重组质粒均经PCR鉴定及测序。

1.4 FXYD6重组蛋白表达及检测 Rossetta菌生长至对数期后用1 mmol/L异丙基-β-8-D硫代半乳糖(IPTG)诱导表达目的蛋白，同时设未加ITPG者为对照组，4 h后收集两组培养液各1 ml，离心收集菌体沉淀，用 100 μl 1×loading buffer重悬，100 ℃煮10 min，离心后吸取上清液置-20℃保存备用。配制15%的十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝胶，15 μl/孔上样，考马斯亮蓝染色，脱色后观察表达蛋白条带。

1.5 FXYD6重组蛋白纯化及检测 ①纯化:离心收集IPTG诱导后的阳性克隆菌体，用含25 mM Tris、150 mM NaCl的裂解液重悬，冰上超声破碎至菌液清亮。15000 rpm 4℃离心20 min后取沉淀，用 25 mM Tris、150 mM NaCl、0.1%Triton X-100 溶液重悬，同样条件离心后取上清，将含有His标签融合蛋白的裂解上清流经Ni-NTA金属螯合柱进行层析纯化，用50 mM咪唑洗脱液竞争结合Ni2+位点，洗脱目的蛋白，超滤将目的蛋白换至PBS缓冲液并进行浓缩。②检测:利用Western blot法。样品经SDS-PAGE后转到NV膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入小鼠源性 His Tag单抗(一抗)，37℃轻摇1.5 h，PBS洗膜3次、每次 5 min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(二抗)，37℃轻摇1 h后同上洗涤，用高灵敏度化学发光检测试剂盒显色，暗室X线压片、曝光、显影后观察。

2 结果

2.1 FXYD6-ex目的片段获得及重组质粒鉴定PCR产物电泳后在DNA marker 200～300 bp出现单一条带产物，片段大小与预期产物大小相符;连接后的pMD18-T Simple Vector和PET-28a经酶切、电泳后亦出现单一目的条带，测序鉴定证实序列完全正确，可进行后续实验。

2.2 FXYD6重组蛋白诱导表达与检测 经IPTG诱导4 h后菌体蛋白相对分子质量约17 kD，较对照组出现明显诱导条带。

2.3 FXYD6重组蛋白纯化及检测 目的蛋白经Ni柱分离纯化、SDS-PAGE电泳后所得目的蛋白纯度达90%;Western blot检测显示，SDS-PAGE上出现的明显诱导条带及纯化所得蛋白可被HisTag抗体识别，而未经IPTG诱导的对照组对应位置未出现条带。

3 讨论

FXYD6蛋白全称为包含FXYD结构域的转运调节因子6，属小分子Ⅰ型膜蛋白。FXYD6基因mRNA首先由Fuminori等于2001年自大鼠脑和肾脏中克隆出，此后的研究主要集中在FXYD6与神经系统的关系方面(如神经元的发育和精神疾病等)。Kadowaki等研究结果表明，大鼠出生后3周时FXYD6的表达在大脑最高，并一直延续至成年。提示FXYD6对于大鼠大脑神经元的兴奋性有重要作用。有关FXYD6与精神分裂症易感性相关性方面的研究，美国、日本和中国研究者得出的结论不一致［1～3］。近期研究显示，FXYD6 蛋白对 Na+-K+-ATP酶的影响有助于产生和维持内淋巴的内耳蜗势能和离子成分稳定，有助于保持内耳听神经的平衡功能［4，5］。目前，有关 FXYD6与肿瘤关系的研究鲜见报道，但FXYD家族突变或缺失很可能引起严重病理变化。已有研究报道FXYD3在人乳腺癌中高表达，有望成为人乳腺癌的标志性分子［6］。本课题组前期研究发现FXYD6在正常胆管或胰腺组织低表达，在胆管癌或胰腺癌组织中高表达并随胆管癌或胰腺癌分化程度降低而增高［7，8］;另外，我们用反义核酸技术发现FXYD6蛋白可促进FXYD6高表达的胆管癌细胞系QBC939和胰腺癌细胞系SW1990细胞增殖。我们近期研究表明，在正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中FXYD6蛋白阳性细胞比率和FXYD6蛋白表达强度依次显著性递增。出现上述研究结果的可能原因为FXYD6基因定位于11号染色体长臂(11q23.3)，而11号染色体长臂是包括胆管癌、胰腺癌在内的多种肿瘤细胞最常见的异常区。基于此，制备FXYD6不同表位的单克隆抗体用以监测其存在和变化非常重要。本研究中，我们采用SignalP 3.0软件分析FXYD6蛋白作为膜蛋白的功能区分布，结果成功进行对FXYD6-ex表达载体的构建、可溶性表达及纯化。

综上所述，本研究成功对FXYD6-ex进行原核表达及纯化;此为后续制备该蛋白抗体库及进一步研究其具体功能奠定了良好基础。

［1］Choudhury K，McQuillin A，Puri V，et al.A genetic association study of chromosome 11q22-24 in two different samples implicates the FXYD6 gene，encoding phosphohippolin，in susceptibility to schizophrenia［J］.Am J Hum Genet，2007，80(4):664-672.

［2］Ito Y，Nakamura Y，Takahashi N，et al.A genetic association study of the FXYD domain containing ion transport regulator 6(FXYD6)gene，encoding phosphohippolin，in susceptibility to schizophrenia in a Japanese population［J］.Neurosci Lett，2008，438(1):70-75.

［3］Zhang J，Che R，Li X，et al.No association between the FXYD6 gene and schizophrenia in the Chinese Han population［J］.J Psychiatr Res，2010，44(6):409-412.

［4］Delprat B，Schaer D，Roy S，et al.FXYD6 is a novel regulator of Na，K-ATPase expressed in the inner ear［J］.J Biol Chem，2007，282(10):7450-7456.

［5］Delprat B，Puel J，Geering K.Dynamic expression of FXYD6 in the inner ear suggests a role of the protein in endolymph homeostasis and neuronal activity［J］.Dev Dyn，2007，236(9):2534-2540.

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［8］刘军桂，周宁新，张效东.FXYD6 shRNA表达载体的构建及其在体外对胰腺癌细胞增殖的影响［J］.生物技术通迅，2009，20(10):458-461.