表观遗传学与结直肠癌的关系研究进展

李 臣综述 陈明清 董 坚审校

表观遗传学(Epigenetics)与遗传学(Genetics)是相对应的概念。遗传学改变是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化,如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等;而表观遗传学改变则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化,如DNA甲基化、组蛋白修饰和基因组印迹等。研究表明遗传和表观遗传异常都参与肿瘤的发生。

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,全世界每年大约有 120万新发病例,同时至少60万患者死亡[1]。结直肠癌有着极为复杂的发生发展机制,传统观点认为肿瘤的主要机制是由于致癌因素造成 DNA序列变异而导致细胞生长、分化失控。近年来,随着研究的深入,发现DNA序列以外的调控机制异常在肿瘤的发生、发展过程中更为普遍[2],这种不依赖于DNA序列变化的可遗传的调控机制即为表观遗传学机制,这也为结直肠癌的诊断和治疗开辟了新的途径。

1 表观遗传学分子机制与结直肠癌

1.1 DNA甲基化与结直肠癌

DNA甲基化是指由 DNA甲基转移酶(DN-MT)催化,把 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到胞嘧啶 5位碳原子上,生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)引起基因表达异常的过程。DNA甲基化包括整体基因组的低甲基化和启动子特殊区域 CpG岛的高甲基化。在散发性直结肠癌中,这两种表观遗传学变化在基因不稳定性产生过程中起着重要作用。

1.1.1 整体基因组低甲基化与结直肠癌 研究表明:肿瘤细胞中 DNA甲基化水平只为相应正常细胞的 1/3～1/4,从而导致重复序列的转录/转座活化和基因组的高度不稳定性。结直肠癌组织中 5-mC含量与正常组织相比亦有明显的下降。低甲基化可引起癌基因如 MDR 1、Ras、c-myc、NT活化,参与肿瘤的发生。在散发性结直肠癌中,这种低甲基化还与染色体不稳定性(chromosomal instability,CIN)和微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)有关。Matsuzaki等[3]的研究显示整体基因组低甲基化可引起 CIN,该研究还发现微卫星稳定性(MSS)结肠癌中杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)出现频率较 MSI结肠癌高,且LOH阳性结肠癌甲基化程度明显低于 LOH阴性结肠癌,同时低甲基化程度高的组织有更多的位点出现 LOH。

1.1.2 区域性高甲基化与结直肠癌 除整体基因组低甲基化外,基因 CpG岛区域的异常高甲基化同样在肿瘤发展过程中起重要作用,这也是目前研究的热点,尤其是抑癌基因启动子区域CpG岛高甲基化导致的转录沉默更是倍受关注,这也很可能是癌性增生的最初表现。

p16基因是重要的细胞周期调控基因,能够使细胞周期稳定在G1期,在多数胃癌和结直肠癌患者中表达下降。多数研究表明,除了少数为等位基因的纯合性缺失外,启动子的过度甲基化是p16失活的主要原因。大约 30%的结肠癌患者有p16基因启动子的甲基化,而且p 16基因启动子过度甲基化的大肠癌具有一些特殊的临床病理特征,如多为右半结肠、女性和低分化癌。

hMLH 1是DNA错配修复基因,大多数的遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)和部分散发性大肠癌(sporadic colorectal cancer,SCRC)(10% ～15%)表现为 MSI,但两者发生 MSI的原因却不相同,前者是由于错配修复基因的突变,而后者则主要是由于hMLH 1基因启动子的异常高甲基化导致hMLH 1基因的沉默表达引起。研究显示MSI(+)的SCRC中 hMLH 1基因启动子过度甲基化的检出率可高达 70%～90%[4],提示 hMLH 1启动子的过度甲基化与hMLH 1蛋白的失表达关系密切。

p14也是细胞周期调控基因,其作用机制是与癌蛋白MDM 2结合,加速 MDM 2降解并促进 MDM 2与 p53分离,促其诱导p53基因下调功能减弱,恢复和稳定细胞 p53水平,增强p53在 G1S/和 G2/M的限制点效应,最终使细胞阻滞于 G1和(或)G2期。此为 p14-MDM2-p53通路学说,即 p14和 p53之间为负相关,p 14的降低可导致p53的异常升高,从而在结直肠癌中发挥作用。p14可以通过等位基因的纯合性缺失或基因启动子的过度甲基化而失活,研究显示近 1/4的大肠癌发生p 14基因启动子的过度甲基化,且 p14启动子甲基化可能为溃疡性结肠炎相关的大肠癌发生过程中的常见的早期分子事件。Kom inami等[5]的研究表明在大肠癌中 p14基因启动子过度甲基化与MSI关系密切,p14基因启动子过度甲基化的大肠癌更常表现为MSI-L,提示p14基因甲基化可能参与低微卫星不稳定性结直肠癌的发生和发展。

APC基因作为结直肠癌的“看门基因”,负责大肠上皮细胞的自稳定,是结直肠癌发生的限速因子,家族性腺瘤性息肉病(fam ilial adenomatous polyposis,FAP)便是该基因突变或丢失引起的,同时在无家族史的结直肠癌患者中 35%～60%也存在该基因的丢失。除了基因的改变外,APC基因启动子高甲基化导致的失活在人类肿瘤中也很常见。Arnold等[6]发现,染色体 5q上发生 LOH并且 APC表达降低的散发性结直肠癌病例,其APC启动子发生高甲基化的频率明显高于染色体 5q上发生LOH但APC表达正常的病例。目前认为,与 5q杂合性丢失相比较,APC启动子异常高甲基化在结直肠癌APC失活机制中可能起着“二次打击”的作用。

RASSF1A基因是 Ras基因超家族的成员,发挥着抑癌基因的作用。2000年,Dammann在肺癌细胞中发现 RASSF1基因。其后的研究表明 RASSF1A启动子甲基化导致的表达缺失与多种肿瘤的发生有关[7]。Wagner等[8]发现,45%(13/29)的结直肠癌病例发生了 RASSF1A基因启动子甲基化,而其 3p21.3等位基因丢失却并没有检测到。这表明RASSF1A基因启动子异常甲基化而失活在结直肠癌中是很常见的事件,目前认为,RASSF1A的失活主要是因为启动子的甲基化而非突变导致。

E-cadherin(上皮钙黏素)存在于正常细胞膜表面,是调节细胞与细胞,细胞与细胞外基质之间黏附反应的重要媒介,在大多数肿瘤组织中则低表达或失表达,与肿瘤的侵袭有着密切的关系,造成E-cadherin表达降低的主要原因是其基因CDH 1启动子 CpG岛的高甲基化。Wheeler等[9]应用甲基化特异性 PcR法检测 28例结肠癌上皮钙黏素基因启动子区 CpG岛甲基化状况,发现 46%发生了甲基化,基因启动子甲基化与上皮钙黏素表达降低显著相关。目前的研究表明,E-cadherin还能与 βcatenin在细胞膜上形成 E-cadherin/β-catenin复合体,通过结合β-catenin阻止其进入细胞核内从而阻断其对下游靶基因的激活而抑制细胞生长和增殖,并促进细胞的凋亡[10]。

1.2 组蛋白修饰与结直肠癌

真核细胞的基因组DNA在细胞核里是以染色质存在的,染色质是由 DNA、组蛋白、非组蛋白及少量的 RNA组成。组蛋白的 N-末端可通过乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等进行翻译后修饰,不同的组蛋白 N-末端有不同的氨基酸(如组蛋白 H 3末端含 7个 Lys和 2个 Ser,H 4末端含 5个 Lys和 1个 Ser),组蛋白的任何 1种修饰都有可能改变组蛋白和各种染色质相关蛋白的亲合力,影响核小体、染色质的高级结构,进而影响基因的转录。其中以乙酰化和甲基化修饰尤为重要。

1.2.1 组蛋白乙酰化 组蛋白乙酰化是组蛋白修饰中研究最多、最透彻的,乙酞化修饰大多位于组蛋白H 3中的第 9,14,18,23位赖氨酸,组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)或组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)共同介导的 1个可逆的动态平衡过程。HAT的作用是将乙酰辅酶 A的乙酰基转移到核心组蛋白N-末端特定赖氨酸残基上,消除了氨基酸残基所带的正电荷,使DNA构象展开、核小体结构松弛,从而促进转录因子和协同转录因子与 DNA结合,激活特定基因的转录;而HDAC则是去除赖氨酸残基上乙酰基的作用,恢复组蛋白的正电性,增加组蛋白与带负电的DNA间的吸引力,从而阻止转录调控元件靠近启动子而达到抑制基因转录的作用[11]。组蛋白的这种乙酰化与去乙酰化的动态失衡将会影响基因转录水平,从而影响细胞的分裂、分化与凋亡,在恶性肿瘤的发生发展中可能起着重要作用。在人结肠癌细胞系 SW 1116和人直肠癌细胞系 Colo-320中,HDAC抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)和丁酸钠通过抑制HDAC,增强乙酰化水平显著上调p21WAF1基因的转录,其细胞周期亦被阻滞于G1期[12]。粗纤维食物可降低结直肠癌的发生率原因可能与其中大量的丁酸盐等短链脂肪酸上调p 21WAF1等抑癌基因启动子区相关的染色体组蛋白乙酰化有重要关系。

1.2.2 组蛋白甲基化 组蛋白甲基化修饰是重要的组蛋白修饰机制,它被认为是染色质是否具有活性的标志。甲基化修饰的部位主要是组蛋白H 3和H 4的赖氨酸和精氨酸两类残基,单个赖氨酸或精氨酸最多可被 3个甲基修饰。组蛋白甲基化和DNA甲基化可联合作用共同参与抑癌基因沉默而诱发肿瘤。

p53基因是发现最早的抑癌基因之一,参与细胞周期调节、DNA修复、控制细胞增生和凋亡。p53功能缺陷的细胞不能诱导肿瘤细胞凋亡,也不能控制肿瘤细胞的生长。目前发现组蛋白赖氨酸甲基转移酶(histone lysine methyltransferases,HKMTs)Set9、Smyd2和 Set8能够甲基化 p53蛋白而(抑制其活性)调节其功能。甲基化位点分别为 p53K 372、p53K 370和p53K 382[13～15]。同时研究发现组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶 1(lysine-specific demethylase 1,LSD 1)也能使 p53蛋白 K 370位点发生特异性去甲基化而抑制p 53的功能[16]。

1.2.3 组蛋白磷酸化 组蛋白的磷酸化修饰主要参与细胞信号通路的活化。ERK-MAPK途径和p38-MAPK途径的激活能引起组蛋白H 3的Ser-10磷酸化,Ser-10的磷酸化在真核生物的基因转录活化中起重要作用。ATM/ATR和 DNA-PK通路激活能够引起组蛋白H 2A变异体 H 2AX的 Ser-139磷酸化,后者参与DNA损伤的修复。

1.3 基因组印迹

基因组印迹是近年来发现的 1种不遵从孟德尔定律的,依靠单亲传递某些遗传学性状的现象,即某些基因呈亲源依赖性的单等位基因表达,另一等位基因则不表达,当这些基因出现遗传印迹丢失(LOI)时就会出现 2个等位基因的同时表达导致肿瘤发生,葡萄胎和畸胎瘤就是遗传印迹丢失引起的肿瘤。在对基因组印迹的研究发现胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF2)基因印迹丢失在结直肠癌的发生中有着重要的意义。IGF2属于癌基因,是第 1个被证实的内源性印迹基因,IGF2基因具有促生长的作用,当其发生基因印迹丢失而使双等位基因同时表达时就会促成肿瘤细胞的异常生长。Cui[17]的研究指出 IGF-ⅡLOI在结直肠肿瘤的早期诊断、预防及疗效监测方面具有重要意义,可作为结直肠癌发生危险性的分子标记物。

2 表观遗传学在结直肠癌中的应用

2.1 表观遗传学在肿瘤早期诊断中的应用

由于表观遗传学可以将DNA、RNA以及蛋白表达等各个层面完整有机地结合在一起,通过对表观遗传学改变进行监测,可以对肿瘤的发生进行预测和诊断。目前应用较多的是对肿瘤DNA甲基化异常的检测,这是因为,与 DNA变异相比,基因甲基化改变常是细胞癌变过程中更为早期的事件,因此可能在肿瘤早期诊断中具有更大的价值。甲基化特异性PCR(MSP)是目前检测基因启动子 CpG岛甲基化中应用最广泛的 1种技术,它是利用经重亚硫酸钠处理后 DNA序列中甲基化和未甲基化CpG岛的差异,然后设计出用于甲基化分析的特异性 PCR引物来进行检测。大多数肿瘤都有多个独立的启动子甲基化事件,因此建立合理的多指标甲基化图谱能为肿瘤风险评估、早期诊断以及肿瘤预后提供有用的信息。Leung等[18]发现检测粪便中7个基因(APC、ATM、hMLH 1、SFRP2、 HLTF、MGMT和 GSTP1)的甲基化诊断大肠癌和腺瘤的敏感度分别为 75%和 68%,特异度为 90%。

2.2 表观遗传学在肿瘤治疗中的应用

与遗传学改变不同,表观遗传学改变是可逆的,通过纠正表观遗传改变为肿瘤的治疗提供了个新的途径,使其成为潜在的肿瘤治疗靶点。大量研究表明 DNA甲基化转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肿瘤具有明显的治疗作用,但由于缺乏特异性和一定的毒副作用在临床运用上仍需进一步研究[19]。不过表观遗传学引起的基因功能异常存在多种机制且相互作用,也提示联合治疗可能将是个很好的治疗策略[20]。

总之,表观遗传学的研究使我们对结直肠癌的发生、发展不再拘泥于基因水平的改变。基因后修饰的异常在肿瘤的发生、发展中可能具有更为普遍和重要的作用。相信随着对其机制的进一步阐明,表观遗传学将为研究结直肠癌的发病机制提供更开阔的思路,并在结直肠癌的诊断、治疗和预防等多方面发挥极为重要的作用。

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