RNA干扰及其在乳腺癌研究中进展*

辽宁医学院附属第一医院普外科(锦州 121001)

朱 培 综述 赵树鹏△ 审校

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链 RNA引发的序列特异性基因沉默现象[1],可高效、特异地沉默特定基因。RNA干扰提出时间并不长,但这项技术已应用于多个领域,并取得了突飞猛进的发展。随着研究的不断深入,RNAi在基因功能研究尤其是肿瘤相关基因研究及肿瘤治疗中的应用方面将有着巨大应用价值。

1 RNAi的发现和发展

1990年,Jorgensen及Mol领导的研究组在矮牵牛属植物中通过添加过量的合成色素的基因拷贝,来增加花瓣紫色的着色。结果不但紫色没有加深,而且一些转基因的花出现白色或全白色。这说明不仅导入的基因未被表达,反而连植物本身的某些合成色素的基因也失活,他们称此现象为共同抑制(cosuppression)[2]。1998年,Fire和Mello等证实 Gou发现的正义 RNA或反义 RNA诱导基因表达抑制是由体外转录制备的RNA中污染了微量的ds RNA而引起,首次提出了RNA干扰学说。同年Richard等同样向果蝇的合胞体中注入对应4个基因的双链 RNA,结果得到了相应基因功能缺失型的表型。这个结果表明 RNA干扰机制不是线虫特有的,很可能广泛存在于不同的生物中。2001年Sayda等[3]用长度为21～25bp的双链RNA在哺乳动物细胞中诱发基因特异性沉默由此证实 RNA干扰机制是生物界一种古老且进化上高度保守的现象。

2 RNAi的机制

在正常生物体内,细胞内的双链 RNA(ds RNA,38个碱基以上)在依赖ATP的情况下,被核糖核酸酶Dicer切割成双链小干扰RNA(siRNA,19～23个碱基)。siRNA这个结构对基因沉默效应有着决定作用。(1)siRNA中有两条链,一条为正义链,一条为反义链,其中反义链可与多种核酸酶结合形成沉默复合物(RISC)[4],同时由于反义链与某一种 m RNA的编码区是同源的,因此可与此编码区互补结合,随之引导 RISC结合m RNA,然后通过依赖于ATP的解螺旋酶解开 siRNA的双链,并将其正义链与靶 m RNA置换,即 m RNA取代正义链与反义链互补,继而核酸酶将mRNA切割成21～23 nt的小片段,切断部位大约在与siRNA反义链配对序列的中部,于是 mRNA发生降解,从而导致基因表达的沉默,干扰了靶基因的表达。(2)RISC中的Rd RP(RNA依赖性 RNA聚合酶)以 siRNA反义链作为引物,以靶 m RNA为模板合成新的dsRNA,然后由 Dicer切割产生新的siRNA,新 siRNA再去识别新一组 m RNA,又产生新siRNA。经过若干次合成-切割循环,沉默信号就会不断放大,甚至穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持。RNAi的特异效应作用是在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个不同的水平上实现的。其中以 siRNA(short interfering RNA)转录后水平的RNAi研究最为深入,应用最为广泛。

3 RNAi的特征

(1)特异性:RNAi是转录后水平的基因沉默机制,有高度的序列特异性。RNAi介导的降解作用的最终调节者是21-mer siRNA,是由dsRNA的核糖核酸酶Ⅲ分裂产生的。退火的21-mer RNA链通过转染引入到细胞中,在细胞内与细胞相关m RNA特异地结合,活化一个RNA降解过程,导致相应的蛋白水平减低 80%～90%。这种高度的序列特异性使dsRNA能够非常特异地诱导与之序列同源的m RNA降解,与其他基因无关。(2)高效性:RNA由于循环放大效应,在低于反义核酸几个数量级的浓度下,就能使目标基因的表达降到极低水平甚至完全抑制,从而产生缺失突变体表型。(3)传播性:RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞膜,在不同的细胞间长距离传递并维持信号,甚至传播至整个有机体。(4)高稳定性:siRNA分子是3'端有突出的非配对碱基的双链分子,在细胞内可稳定存在 3～4d,半衰期长于反义寡核苷酸。(5)三磷酸腺苷(ATP)依赖性:在去除ATP的样品中RNAi现象降低或消失,显示RNAi是一个ATP依赖的过程。

4 siRNA的合成方法与途径

(1)化学合成:设计出 siRNA序列后,由合成仪按照序列进行合成及后续的纯化。(2)体外转录:针对siRNA的序列合成对应的DNA链,再利用 RNA聚合酶进行体外转录,转录产物即可导入细胞。(3)siRNA表达框:本质是一段含有能表达siRNA分子的PCR产物,无需克隆入载体即可导入细胞抑制特定基因的表达。(4)siRNA表达载体:是将 siRNA对应的DNA双链序列克隆入载体内,位于RNA聚合酶Ⅲ的启动子后,在体内表达所需的siRNA分子。使 siRNA直接在体内得到表达,可用于RNAi长期研究。(5)“鸡尾酒”法(RNasem酶切 dsRNA):其过程如下,首先针对靶基因的mRNA在体外转录合成长dsRNA;再用 RNasem或 Dicer对长ds RNA进行酶解,形成一组siRNAs的混合物;最后将该混合物导入细胞内。

5 RNAi在乳腺癌中的体外研究

5.1 乳腺癌的侵袭与转移相关基因的RNAi Gu等[5]通过构建针对人 VEGF-C基因的siRNA表达载体,利用 RNA干扰技术沉默V EGF-C基因,VEGF-C基因及蛋白水平表达量明显降低,COX-2和Bcl-2的表达减弱,细胞体外活性下降,72 h后凋亡率达 60%,乳腺癌细胞 MDA-MB-435的凋亡明显增加。赵矫[6]构建人端粒酶逆转录酶(h TERT)基因的RNA干扰表达载体,并转染致 MCF-7细胞内,结果以 DNA质粒为载体的siRNA能有效抑制h TERT基因的表达,进而抑制乳腺癌M CF-7细胞生长、促进细胞凋亡。Liu等人设计两对针对 C35编码区的si RNA,并合成构建到转录载体pTZU6+1上,形成重组质粒siRNA-C35,在脂质体介导下转染乳腺癌细胞株 T47D,结果显示,质粒 p TZU6+1、psh RNA-C35-1和psh RNA-C35-2组的相对表达率分别是脂质体对照组的95.3%、40.0%和28.4%。siRNA转录载体转染乳腺癌细胞株能有效抑制乳腺癌细胞中C35基因的表达。Ma等[7]构建 FAK基因 siRNA的重组质粒FAK-siRNA,在脂质体的介导下转染入人乳腺癌M CF-7细胞,成功转染 FAK-siRNA后乳腺癌 MCF-7细胞 FAK基因的表达与阴性对照组、空白质粒转染组相比 FAK m RNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖指数及侵袭力明显降低。Huang[8]通过siRNA抑制 MDA-M B-453细胞中 AP-2α的表达,下调乳腺癌细胞 MDA-MB-453中 HER2 m RNA及其蛋白的表达,抑制 le了MDA-MB-453细胞的生长,提示 AP-2α基因在乳腺癌细胞的发生、发展中具有重要作用,AP-2α可能是 HER2过量表达乳腺癌的治疗靶点。Guo[9]体外化学合成 AnnexinⅡ基因序列特异性双链小干扰 RNA(AnnexinⅡ-siRNA),并转染致高转移人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231中,AnnexinⅡ-siRNA能有效抑制 AnnexinⅡ mRNA和蛋白表达,经 si RNA处理的细胞,细胞生长速度明显降低,侵袭迁移力显著下降。孙梅成功构建siRNA-MK表达质粒,并有效沉默 MK基因的表达。沉默M K基因后,通过对基质金属蛋白酶(MM P-2和MMP-26)的影响,降低肿瘤细胞和基质之间的粘附性、肿瘤细胞的迁移能力和肿瘤细胞的侵袭性,从而降低肿瘤的侵袭和转移。

5.2 RNAi用于抑制乳腺癌细胞耐药基因的表达Jia[10],通过 shRNA-BCAR1抑制乳腺癌细胞 BCAR1基因的表达,BCAR1基因在 m RNA水平和蛋白水平表达均明显抑制。BCAR1表达被抑制后,癌细胞对抗雌激素药物 TAM的耐药性明显降低。Tang[11]构建干扰乳腺癌细胞 BCRPm RNA的腺病毒载体,采用细胞毒性实验和外排实验检测 p Ad-BCRP感染后,显示 Ad-BCRP可将 B37/MX细胞对米托蒽醌的耐药指数从 978降低至75(92.3%逆转)。感染 p Ad-BCRP和未感染的B37/MX细胞外排1 h后细胞内的米托蒽醌的荧光强度分别为56.4和12.8。从而证实p Ad-BCRP能显著降低乳腺癌 B37/MX细胞中BCRP的表达并抑制BCRP的功能。Li[12]利用 RNA干扰技术,选择耐阿霉素人乳腺癌细胞 M CF-7/ADR及其敏感细胞系MCF-7作为研究对象。将预先设计的siRNA包装入质粒载体,然后转化质粒到大肠杆菌中,经过克隆、扩增、纯化后转染到细胞中沉默基因 mdr1,显示 MCF-7/ADR细胞经特异性siRNA作用后,P-gp的表达率由 99%下降到 12.3%,阿霉素耐药实验显示,转染 siRNA的MCF-7/ADR细胞 IC50为0.51umol/L而未转染组的IC50为17.88 umol/L从而为siRNA作为一种可能的治疗手段提供了理论依据。

5.3 乳腺癌的细胞周期调控 魏钦俊通过构建靶向DNMTI基因的短发夹状 RNA重组质粒,从 mRNA水平来抑制 DNM TI基因的表达,解除乳腺癌发生相关基因启动子区的高度甲基化,抑制乳腺癌细胞的异常增殖或逆转乳腺细胞的恶性转变,证实重组质粒 p GCsi-T2、p GCsi-T3对乳腺癌 Mc F一 7细胞中 DNM TI基因的转录均有明显的抑制作用,抑制率分别为64.2%和74.7%。McF-7细胞转染后,p GCsi一 T3重组质粒明显抑制乳腺癌 M CF一 7细胞的增殖;大量细胞发生凋亡;细胞周期分析可见 S期明显减少,而 Gl/GO期细胞显著增加。张宁在乳腺癌组织及癌旁组织中检测到moesin基因在高表达,利用 RNA技术,通过慢病毒介导沉默乳腺癌细胞moesin基因后,降低 Rho A、Racl基因表达,下调 cyclinDl基因,抑制细胞 Gl期-S期转换;通过下调 p-gP蛋白表达水平影响 MCF-7/ADR耐药能力,使细胞不再适应原有培养环境,出现细胞增殖抑制和凋亡改变;通过下调 CD44v 6、MMP一 7蛋白表达水平,上调 E-cadherin蛋白表达水平影响细胞侵袭转移能力。张海雁[13]用脂质体介导法将 p BBS212-h TR(反义端粒酶 RNA真核表达载体)导入人乳腺癌细胞 M CF-7中,端粒酶反义 RNA能显著抑制 MCF-7细胞的端粒酶活性,调节细胞周期,抑制MCF-7细胞的增殖并诱导其凋亡。

5.4 RNAi与肿瘤细胞信号转导 通过病毒载体介导的RNA,沉默乳腺癌细胞 HGF受体 c-Met的表达,阻断 HGF-c-Met信号传导通路,抑制乳腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡。

6 RNAi在乳腺癌中的体内研究 Wu[14],构建 S100A4基因特异性 sh RNA表达载体,经过脂质体介导将 S100A4-shRNA表达载体转染入MCF-7细胞,建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型后并进一步注入裸鼠移植瘤内。所构建的S100A4-sh RNA表达载体转染 MCF-7细胞 48 h后,能有效抑 S100A4的表达,并且显著降低 MCF-7细胞增殖水平,以及诱导细胞进入晚期凋亡。稳定转染 S100A 4-sh RNA表达载体的MCF-7细胞形态无显著变化,但其侵袭力和迁移力明显下降;裸鼠体内成瘤实验也显示实验组裸鼠移植瘤的体积和质量明显小于空白对照组和阴性对照组。Wang[15]应用化学修饰的小干扰 RNA(siRNA)沉默人裸鼠乳癌移植瘤新生血管中的血管内皮生长因子受体-1(V EGFR-1)基因,抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长,移植瘤增长趋势受到明显抑制。Li应用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)阻断裸鼠乳癌移植瘤中血管内皮生长因子 C(V EGF-C)基因,VEGF-CsiRNA处理组瘤组织的增长受到明显抑制,V EGF-C基因的m RNA和蛋白表达水平显著降低,抑制肿瘤的生长。Huang[16],构建 PI3K基因 siRNA质粒Psilencer1.0-U6-PI3K-siRNA,建立人乳腺癌裸鼠移植瘤动物模型,应用 siRNA沉默磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidy linositol-3 kinase,PI3K)基因,肿瘤内 PI3K基因表达水平明显下降,Fox O3a基因的表达水平明显升高,肿瘤生长抑制,裸鼠的生存时间延长。Smith等[17]使用载体介导的RNAi转入四期人乳腺癌的高度转移的裸鼠动物模型,特异性抑制了CX CR4基因表达。接种亲本细胞的裸鼠肿瘤发生自发性转移,并最终死亡,而所有接种靶向 CXCR4基因的si RNA表达载体细胞的裸鼠肉眼观察无转移形成,且部分裸鼠无肿瘤形成。证明抑制 CXCR4基因可以提高原发性和转移性乳腺癌病人的治疗效果。

7 应用前景与问题 RNA干扰现象的发现为肿瘤基因治疗开辟了一条新道路,RNA干扰在生命科学领域的研究将是肿瘤生物学研究的热点和前沿,而且有着广泛的前景。RNAi技术已经日渐成为乳腺癌基因治疗中令人关注的研究热点。RNAi技术可以高效、特异的抑制多种与乳腺癌发生发展和耐药相关的基因表达,为乳腺癌的有效治疗提供新的方法。特别是 RNA干扰在乳腺癌细胞体内研究的日渐成熟为乳腺癌基因治疗用于临床提供了可能。但是李媛虽然成功构建针对人ER81m RNA序列 si RNA表达载体 p Genesil1-ETV 1A/ETV 1B/ETViC-siRNA,沉默乳腺癌 MDA一 MB一 231细胞ER8l基因,抑制了ER81m RNA的转录与蛋白的表达,但是并不促进乳腺癌细胞凋亡。可见乳腺癌的发生是多基因共同作用的结果,单纯抑制某种基因意义不大。目前关于RNA干扰多基因的实验研究面临诸多技术难题,鲜有报道。尽管乳腺癌细胞体内研究有了很大进步,但是关于RNAi的体内应用的安全性研究十分不足,所以 RNAi的肿瘤基因治疗应用于临床仍然十分遥远。

[1] Yang M,Mattes J.Discovery,biology and therapeutic potential of RNA interference,microRNA and antagomirs[J].Pharmacol Ther,2008,117(1):94-104.

[2] van der Krol AR,Mur LA,de Iange P,etal.Inhibition of flower pigmentation by antisense CHS genes:Promoter and minimal sequence requirements for the antisense effect[J].Plant Mol Biol l990,14(4):457-466.

[3] Sayda M E,Jens H,Winfried L,etal.Duplexes of 21±nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured Mammalian cells[J].Nature,2001,411:494-498.

[4] Hannon GJ.RNA interference[J].Nature,2002,418(6894):244-251.

[5] Gu F,Zou Q,Ni Q.Vascular endothelial cellgrowth factor-C small RNA interferingvector down-regulate COX-2,Bcl-2 and induceapoptosis in human breast cancer cells[J].Fudan Univ JMed Sci 2009,36(2):168-171.

[6] 赵 矫.siRNA表达载体对h TERT基因的效应评价[J].陕西医学杂志,2009,38(1):7-10.

[7] Ma J.Effect of s ilencing FAK gene expres s ion by s i RNA on characteris tics of human breast cancer MCF-7 cell line[J].Journal of Chongqing Medical University,2009,34(5):542-546.

[8] Huang QC,Cao JH.Effects of RNAi-mediated Gene Silencing of AP-2αTranscriptionalFactor on the expression of HER2O verexpression and Cell Proliferation In Breast Cancer Cells MDA-M B-453[J].The Practical Journal of Cancer,2009,24(4):345-347.

[9] Guo BQ.Effect of s ilencing annexinⅡby s pecific siRNA on invas ion and metas tas is of human breas t cancer cell MDA-MB-231[J].Journal of Chongqing Medical University,2009,34(8):984-987.

[10] Jia YC.The effects of BCAR1inhibited by RNA interference on tolerance to antiestrogen drugs in human breast cancer cell[J].Ning Xia Med J,2008,130(10):865-867.

[11] Tang Y.Construction of RNAi recombinated adenovirus targeting BCRP and its inhibitive effectsonBCRP[J].Chin JCancer Prevtreat,2008,15(18):1374-1376.

[12] Li CB.Reversing Multidrug Resistance in Breast Cancer cell Line MCF-7/ADR by small interfering RNA[J].Cancer,2004,23(12):1605-1610.

[13] 张海雁.脂质体介导端粒酶反义 RNA对人乳腺癌细胞MCF-7活性及增殖的影响 [J].陕西医学杂志,2009,38(9):1146-1148.

[14] Wu AG.Inhibitory effects of silencing S100A4 gene by sh RNA on the growth and invasiveness of breast cancer MCF-7cells[J].Tumor,2009,29(8):715-720.

[15] Wang MM.The effect of RNA silencing V EGFR-1 gene on inhibition of breast cancer[J].Med J Qilu,2009,24(4):292-294.

[16] Huang WY.Silencing PI3Kby si RNA activated Fox O3agene and inhibited the growth of xenografted breast carcinoma in nude mice[J].Tumor,2008,28(4):310-312.

[17] Smith MC,Luker KE,Garbow JR,etal.CXCR4 regulates growth of both primary and metastatic breast cancer[J].Cancer Res,2004,64(23):8604-8612.