蛋白质和多肽的放射性标记方法研究进展

程秋雁

(江苏省南京市市级机关医院药剂科,江苏南京,210009)

蛋白质和多肽的放射性标记广泛用于药代动力学研究,医学影像检查[1],抗体标记,二维电泳[2]等方面,在医学和药学领域是一种重要的技术。蛋白质和多肽的标记常用125I或131I标记[3-4]酪氨酸。标记方法一般是用氯氨 T法进行碘放射性标记,用柱层析法和离心超滤法对标记物分离纯化,同时用三氯乙酸沉淀法和SDS-PAGE电泳法鉴定纯化后的标记化合物放射化学纯度,用MT T比色法测定标记物的生物学活性。例如徐贤坤等[5]改进的双相氯氨 T法标记了聚乙二醇化重组人白细胞介素6标记率可达74.5%,高于常规氯氨T法的62.3%,放射性比活度分别为5.151 3×109和4.161×109BqPμ g。经柱层析法和离心超滤法对标记物分离纯化后,用三氯乙酸沉淀法测得放射化学纯度均能达到 99%以上。用SDS-PAGE电泳法检测2种标记方法所得的标记物与非标记物的结果表明,常规氯氨T法标记物比非标记物多1条高分子量蛋白带,认为是标记过程中蛋白质受到部分损伤。改进的双相氯氨T的标记物与非标记物蛋白质条带一致,认为蛋白质标记后基本没有受到损伤。生物活性检测表明改进的双相氯氨T标记物与非标记物活性之间无显著差异,常规氯氨T法标记物活性略低于双相氯氨T的标记物活性。

放射性标记方法的分类方法有很多,根据标记的过程不同分为直接标记法和间接标记法[6]2大类。直接标记法的标记过程相对简单,在大多数情况下,放射性核素通过降解多肽分子内的二硫键后与自由巯基结合。直接标记法较多应用于大分子蛋白质诸如抗体及其片断的标记也成功应用于血小板受体结合多肽的标记。然而,直接标记法的标记过程难以控制,也难以了解标记时多肽参与反应的原子数量和放射性核素络合的几何形状,并有可能造成多肽的结构、稳定性、生物活性和药代动力学发生不可预料的改变。对于不含二硫键的多肽直接标记法并不适用,即使对于含二硫键的多肽,环状结构的微小改变对其生物活性也会产生巨大影响。

目前用于蛋白质和多肽放射性标记的元素有很多,例如3H,18F,99mTc,72As,188Re,75Br,86Yt等等,其中各种元素的标记方法和应用范围也不尽相同。作者对其中几种元素的放射性标记方法做一下简单的介绍。

1 放射性砷标记

放射免疫治疗属于内照射治疗,可以用较少的单克隆抗体耦联放射性核素,在肿瘤局部产生足够的电离辐射生物学效应,达到高效低毒的治疗效果[7]。Jennewein等[8-9]在传统的化学标记砷方法得基础上建立了新方法对单克隆抗体进行了放射性砷标记。长半衰期的72As(T1/2=26 h)和74As(T1/2=17.8 d)可以减慢生理作用进程,类似于浓集肿瘤组织中单克隆抗体的分布。砷标记化合物方法重复性好,且砷标记化合物有亚毒性和亚药动学富集作用。他们标记了2个蛋白,分别是嵌合IgG3单抗ch3G4和利妥昔单抗IgG3。其标记方法是:先将抗体用SATA标记,随后在羟胺的作用下脱去作为保护剂的乙酰基,使抗体带上巯基,巯基化的抗体可以跟72AsI3或74AsI3反应,得到的产物再水解即砷标记的单克隆抗体。这一方法的产率高(>99.9%),并且在临床环境中易于操作。

2 188Re标记

内动脉灌注标记颗粒是治疗肿瘤的一种有效地腔内放射疗法。Wunderlich等[10]发展了一种用简单可靠的方法对可降解的人血清蛋白进行短半衰期β-发射粒子188Re标记。经过条件的优化,这种188Re标记方法的标记效率可以达到接近100%,并且188Re标记颗粒在体外稳定存在。这一方法包括3个试管,试管1中是9.3 mg(60 μ mol)二羟苯甲酸和 11.4 mg(50 μ mol)氯化琥珀胆碱二羧酸亚锡溶解在2 mL无菌、无热源注射用水中;试管2包括10 mg人血清蛋白微体,2.4 mg吐温80;试管3包括150 μ mol酒石酸钠。试管1中的溶液用注射器完全转移到试管2中。轻轻震摇试管使人血清蛋白微体悬浮。一定剂量的188Re转移到含有人血清蛋白的试管2中。为了进行反应,把试管2加热到95℃,震摇1 h。然后,把试管3中的物质溶于1 mL注射用水中,再把试管2中的溶液加到试管3中,室温震摇10 min。这个方法可以用一个简单的试剂盒有效的标记人血清蛋白颗粒。pH值为2,反应90 min,放射标记效率为85%～90%,为了避免洗涤步骤,减少放射性风险,在反应进行1h时加入酒石酸锑钾,然后pH值从2提高到4～5,发现188Re反应几乎可以定量。

3 3H标记

糖蛋白的定点P-糖蛋白(Pgp)是ATP依赖药物泵,用于抵抗多重耐药的癌细胞。Andrus[11]等得到了一种新的抗多重耐药的癌细胞的天然化合物:(-)-stipiamide,但是毒性很高。于是其进行了结构修饰得到了无毒的化合物6,7-dehydrostipiamide和truncated-DHS。先合成了DHS,然后用放射性试剂[3H]-BZDC对DHS进行放射性标记,得到了一种新型放射性抗癌试剂。然后,用放射性标记试剂与Pgp进行光亲和性反应在365 nm照射下反应1 h,用SDS-PAGE进行检测。反应加入环孢菌素A后,标记效率提高,大部分Pgp被标记。

另外,3H标记还可以用于蛋白质相互作用的足迹分析。Mousseau[12]等利用稳定的C-3H共价键标记对蛋白质之间相互作用进行了分析,得到了较好的效果。

4 11C标记

11C的半衰期为20.4 min,可以用稳定的共价键与蛋白结合。常用的11C标记试剂是11C标记的CNBr,11C标记的CH2O,11C标记的CH3I等。其中[11C]CNBr可以将转铁蛋白和人血清白蛋白在接近生理条件下(40℃,5 min,pH值8)高特异性标记上[13]。其放射性随蛋白含量2增加到25 mg/mL而从20%增加到70%～80%。尽管游离的巯基也可以与[11C]CNBr反应,但是[11C]CNBr还是优先与赖氨酸的氨基反应。整个反应时间在30 min之内,标记后半衰期为20 min,可以用于检测血管和肺的渗透性以及红细胞比容的分布。[11C]CH2O可以磷酸盐缓冲液中与人血清白蛋白,纤维蛋白原或促黄体激素的氨基反应,然后在硼氢化钠的作用下发生还原反应,形成稳定的共价键。[11C]CH3I是应用最广泛的标记前体,人血清白蛋白可以在磷酸盐中与[11C]CH3I发生反应。但是人血清白蛋白的耐热能力比一般蛋白要强,所以这些条件并不适合其他蛋白的标记。例如锚定蛋白在甲醇中与[11C]CH3I加热到80℃反应时难以保持活性的。因为这一蛋白在56℃加热10 min就会完全失去活性[14-15]。

5 18F标记

18F的半衰期为110 min,18F用于亲和标记的在高pH和温度以及有机溶剂中进行,这些条件会破坏蛋白的生物学活性。因此蛋白要与18F标记的辅基反应。这些辅基必须可以快速与蛋白上的基团发生反应。大多数18F的辅基都是与蛋白上的N-末端氨基或多个赖氨酸的氨基发生反应,选用蛋白中含量较高的赖氨酸含量大大增加了标记的可能性,但是选择性不高。[18F]氟苯甲醛([18F]FBA)与蛋白的氨基反应,因此最近报道的标记策略倾向于更加有选择性的方法,例如巯基修饰策略。大多数巯基选择性修饰剂都是针对半胱氨酸残基的。由于大多数蛋白中只有少数半胱氨酸,所以特异性标记还是可以实现的。[18F]FBABM对于模式多肽在PBS中反应10 min有很高的产率,但是这个分子中含有一个杂质从而降低蛋白的量。当杂质除去后,其修饰锚定蛋白v巯基的产率达到37%。[18F]FBABM也可以成功的标记低密度膜蛋白,产率也达到了20%。另外还有其他的标记策略,例如一种18F标记的新方法是用Al18F作为标记试剂,Al18F可以作为螯合剂与多肽稳定结合[16-18]。

结 语

蛋白质和多肽的放射性碘标记技术已经成熟,应用也很广泛。其他的放射性标记技术也在蓬勃发展,放射性元素的种类在不断的增加,标记策略呈现多样性,并且蛋白质和多肽的放射性标记技术的应用的范围也得到了扩大。

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