Livin基因与肿瘤的研究进展

西安交通大学医学院第二附属医院呼吸内科(西安 710004)柴春艳 综述 李雅莉 审校

凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apop tosisp rotein,IAP)是近年来备受瞩目的一类蛋白家族,是一类新的独立于 Bcl-2的抗凋亡蛋白。某些 IAPs成员异常高表达常引起组织凋亡受阻,与肿瘤的发生发展密切相关。通过 RT-PCR、Northern blot等技术检测发现 Livin基因在胎儿发育过程中的多种组织中有高表达,在大多数成人组织中(除胎盘外)低表达或不表达,而在多种恶性肿瘤组织或细胞株如黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌、鼻咽癌、胃癌、非小细胞肺癌和白血病等中均表达增高[1～6]。表明该基因可能在肿瘤的发生和发展中起着重要作用,并有研究认为癌症患者放化疗的耐药与 Livin基因的表达水平有关。 Cmkovic等[7]研究发现 He-la细胞抵制阿霉素、射线和 TNF诱导的凋亡的机制在于细胞内 Livin基因过表达,用siRN A靶向干扰 Livin的表达后能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。据此,Livin基因有可能成为肿瘤治疗的潜在分子靶点,是目前肿瘤研究的新热点。

1 Livin基因的结构 Livin(又称 M L-IAP/KIAP)是于 2000年 Lin等[8]根据 IAPs基因同源序列,在人的胎肾cDN A文库中发现的新成员,当时将其命名为 KI-AP(Kidney inhibitor of apop tosis protein);同年,Vucic等[1]发现该基因在黑色素瘤细胞中高表达,并称其为 M L-IAP(Melanomainhibitor of apop tosispotein);2001年 Kasof等[9]将之命名为 Livin并沿用至今。

Lin等[3]用荧光原位杂交方法确定 Livin基因位于人 20号染色体 20q13.3区域,全长 4.6 kb,包含 7个外显子。此外还发现存在长约 2.2,2.8和 4.0 kb的转录子 ,Livin蛋白 N端仅包含一个 BIR结构,包含 4个α螺旋和一个三股抗平行β片层,与相应的氨基酸残基共同构成疏水核心。C端含有一个RN G环指结构[2,4],氨基酸残基 C124,C127,H44及 C151与锌原子结合,借以稳定整个重叠结构。 2001年,Ashhab等[10]研究发现 Livin有两种异构体,是同一基因转录后由于剪切方式的不同而形成的两种 mRNA亚型,命名为 Livinα和 Livinβ,两者仅在外显子 6处有 54个碱基的不同 ,分别编码 298个氨基酸和 280个氨基酸的蛋白质。两种异构体蛋白的结构高度相似,均只含有一个 B IR结构域和一个 R ING结构域,在这两种结构域之间有 18个氨基酸的差别。但在体外实验显示两种异构体具有不同的抗凋亡特性和组织表达:两者都能抑制由TN F-α诱导的凋亡,但只有 Livinβ能够阻断足叶乙甙诱导的凋亡[2];在对多种实体肿瘤 Livin表达的研究中,两种亚型常同时表达,但仅有 Livinα在浅表膀胱癌的复发早期表达[2];用siRN A技术沉默 Hela细胞中 Livinβ的表达而不是 Livinα才能够阻抑细胞株的生长[11]。是何原因导致了这样的差别 ,目前尚无明确结论,初步的设想认为在外显子 6处 Livin α较 Livinβ多出 54个碱基形成的 18个氨基酸序列可能形成一定的空间结构而造成明显的功能差异[12]。但具体的机制仍需要进一步深入的研究。

2 Livin基因的作用机制

2.1 Livin与 Caspases蛋白 Livin具有抗凋亡的作用已经在很多实验观察和临床研究中得到证实,但对于 Livin在体内具体的作用机制目前尚未完全阐明。目前的研究认为它可以作为一种酶抑制剂通过 B IR结构域与凋亡过程中激活的核心物质 Caspases蛋白如 Caspase-3、Caspase-7等结合并导致Caspases蛋白的失活和降解。Caspases蛋白是细胞内的天冬酰氨特异酶切的半胱氨酸蛋白酶家族,是介导凋亡的主要因素之一。大多数刺激物都是通过激活 Caspases蛋白的级联反应而引起凋亡的。在 Fas/caspase-8诱导的死亡受体途径中,Livin直接抑制该途径中的核心 Caspases-3蛋白酶的活性;而在另一条细胞色素 C/Apof-1作用的线粒体途径中,Livin也能与Caspase-9前体蛋白及其激活形式结合或通过阻断 Caspase-3对 Caspase-9前体蛋白的反馈激活从而产生抗凋亡的作用。但也有学者在对黑色素瘤细胞株的研究中发现了一个令人迷惑且自相矛盾的现象[13],Livin在与 Caspase-3、Caspase-7结合产生抗凋亡作用的同时也能够被 Caspase-3和 Caspase-7在特异的 Asp-52位置处裂解,而且通过转染实验发现 Livin裂解后的亚单位反而获得了促进凋亡的能力而同时 Caspase-3和Caspase-7的活性也被抑制。这种现象表明 Livin对于 Caspases蛋白有复杂的调节机制,也表明了 Livin结构的完整性是 Livin发挥抗凋亡作用的前提条件。对于该现象最近的研究有了一些新观点:Nachmias等[14]发现完整的 Livin蛋白在细胞胞浆内弥散地分布,而裂解后截短的 Livin(Truncated Livin,tLivin)定位于细胞核周高尔基体。利用突变分析发现了 tLivin促进凋亡的两个重要功能区域—裂解后暴露的氨基末端和RN G结构域,前者决定了 tLivin在核周的定位,并且只有在正确定位后,tLivin的 RNG结构域才能发挥它促进凋亡的功能。

2.2 Livin与 TAK1/JN K1途径 近年的研究发现 JNK1途径在 IAPs抗凋亡中发挥重要作用,是 Livin对抗 TNF-α和白细胞介素-1β转化酶(ICE)诱导凋亡的一条重要途径[15].Livin能够直接结合转化因子 β激酶(Transforming growthfactor-β-activated kinase,TAK1)来激活丝裂原激活蛋白 JNK1,T AK1结合蛋白 (TAK1-binding protein,T AB1)是TAK1的共反应子,TAB1本身对 JNK1无激活作用,但 Livin可与 TAB1结合进一步激活 T AK1。

2.3 其他途径 还有学者认为具有 RNG结构域的IAPs如 Livin等具有泛素连接酶(Ubiquitin Ligase,E3)的功能[16]。泛素能够与靶蛋白共价结合,导致靶蛋白发生泛素化,然后再被一种蛋白水解复合物降解并失去靶蛋白原有的功能。Livin可以作为一种泛素连接酶 ,使其靶蛋白 Caspases发生泛素化并降解从而抑制细胞凋亡。Livin作为泛素连接酶还可以导致 Smac/D IABLO蛋白的降解[10]。 Smac(Second mitochondria derived activator of caspases)又 称 作 DIAB-LO,是IAP家族重要的负性调节蛋白,是在凋亡信号的刺激下,由线粒体释放入胞浆,在胞浆内成熟与 IAPs的 B IR端直接结合而抑制 IAPs的活性。Livin使 Smac蛋白泛素化并降解后可间接阻止 Smac对抗 XIAP的凋亡抑制作用[17]。在对其它 IAP蛋白作用机制的研究发现 IAPs还可以通过 N F2 κB激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶途径、钙离子结合蛋白等方式发挥抗凋亡作用。Livin是否也有类似的作用方式还有待研究进一步证实。

3 Livin基因在肿瘤中的表达

3.1 泌尿系统肿瘤 Gazzaniga等[6]的研究发现,RTPCR检测膀胱癌细胞时 Livin-a在 24例正常膀胱组织中不表达,而在 7例(23%)患者中表达,而 Livin-β没有检测到。通过对基因表达和复发时间的分析发现,Livin的表达,Bcl-2/Bax的高比率,bcl-XL的表达对预测复发有统计学意义,尤其Livin-a在膀胱癌的复发早期时表达,提示 Livin在浅表性膀胱癌的演变中起一定作用,并且可以作为肿瘤早期复发的标志。Wagener等[18]应用 RT-PCR、免疫印染、免疫组化等技术对数百例肾细胞癌细胞和正常肾细胞进行研究,发现肾细胞癌细胞和正常肾细胞中均存在 Livin的表达,且亚型相同,但在肾细胞癌细胞中表达显著增加。刘贤奎等[19]通过对 46例膀胱移形细胞癌患者的研究中也发现,与正常人相比,膀胱移形细胞癌患者的抗 Livin抗体水平增加非常明显。Livin在膀胱移形细胞癌中的过度表达提示其可作为分子治疗膀胱移形细胞癌的一个靶点。Kempkensteffen[20]的研究也表明了这一点,Livin可作为肾细胞癌分子治疗的一个靶点,而不是评估预后的一个因素。

3.2 呼吸系统肿瘤 Hariu等[17]研究表明 Livin与肺癌有一定的相关关系,他们应用 RT-PCR方法检测到 Livin可在许多肺癌细胞株和原发性肺癌组织中呈异常表达,而在正常的肺组织中却未见表达。Tanabe等[21]也用 RT-PCR检测 38例非小细胞性肺癌(NSCLC)肺癌组织 Livin的 mRN A表达情况,并与 15例正常肺组织作对照,结果发现肺癌组织 Livin mRNA表达率为 76.3% (29/38);而正常肺组织表达率分别为 6.7%(1/15)。这一研究结果显示 Livin在 NSCLC发生发展中起着重要作用,并且可通过检测 Livin的表达情况,有助于肺癌患者的诊断。 Yagihashi等[22]研究还发现:51.3%(19/37)的肺癌患者血清 Livin抗体的检测为阳性,因此,如能检测到 Livin抗体同样将有助于肺癌患者的诊断。

3.3 黑色素瘤 对 Livin在黑色素瘤治疗方面的研究也颇为深入,V ucic等[23]发现 Livin的过度表达能够抑制恶性黑色素细胞发生凋亡,潜在地促进黑色素瘤癌基因的表达。而且高表达 Livin基因的黑色素瘤细胞也可以阻断抗癌药所致的细胞凋亡,使其对化疗药物不敏感;因此,检测患者体内 Livin的表达率,可指示该患者对某化疗药物的敏感性[24]。如果能找到一种药物可以降低 Livin的表达,就可以抑制这种黑色素瘤细胞的增殖。Puri等[25]研究发现 T-oligos(一种寡肽)就能大大地下调 Livin基因的表达。这为我们治疗恶性黑色素细胞瘤提供了一种更好的方法。

3.4 消化系统肿瘤 相关报道表明,Livin在多种消化系统肿瘤中呈现高表达。 Ashhab等用 RT-PCR技术检测发现Livin-a和 Livin-β在结肠癌细胞系 HT29M TX、HT29中呈高表达。黎军和等[26]通过对 81例行根治性手术后的 Dukes’B期的结直肠癌组织的研究发现。 Livin在 Dukes’B期结直肠癌组织中的阳性率为 45.7%,明显高于正常对照组的 8.3%(P＜0.05)。Cox多因素分析显示 Livin阳性为 Dukes’B期结直肠癌独立不良预后因素(P=0.047)。 Yagihashi等[27]通过对胃肠肿瘤中的 Livin mRN A研究发现,Livin mRNA可在胰腺癌细胞系AsPC◦ 1、结肠癌细胞系 HT-29、肝癌细胞系(HepG2)等细胞系中表达,在胰腺癌细胞系 AsPC-1和结肠癌细胞系 HT-29表达较高 ,与 GAPDH mRN A的比值分别为 0.78和 0.42,而在另外 2个胰腺癌细胞系(MIA PaCa-2和 BxPC-3)、胃癌细胞系(M KN-1)和另外 2个结肠癌细胞系(LSll80和 SW620)中未检测出 Livin mRN A。以上研究表明,检测 Livin抗原有望成为发现肿瘤的新方法。

4 Livin与肿瘤治疗 Crnkovic-Mertens等[7]利用基因转染和特异性小干扰 RNA(siRNA)技术,在肺癌 SPC-A1细胞株中建立 Livin异构体α和β特异的基因沉默体系,观察诱导 SPC-A1细胞凋亡效应中的不同作用,并用 TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示内源性 Livinα和 Livinβ基因沉默后,SPC-A1细胞克隆形成能力较对照组显著下降,促使 SPC-A1细胞发生凋亡,表明 Livinα和 Livinβ两种异构体均能作为诱导肺癌细胞凋亡的分子靶点,通过使 Livin基因沉默的靶向诱导肺癌细胞凋亡可作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。 Schmollinger等[28]发现 Livin可作为一个抗原靶点来治疗黑色素瘤,高滴度 IgG抗体可以识别 Livin并与之结合,使其失去活性,从而达到治疗黑色素瘤的目的。

由于 Livin在多种肿瘤中高表达,在一些肿瘤细胞中特异表达,研究 Livin的作用机制可为肿瘤的发生发展、诊断、治疗及预后提供重要的理论依据,有望成为肿瘤的标志物,可能成为肿瘤治疗的新靶点,为肿瘤的诊断治疗开辟一条新途径。

5 展望 Livin作为 IAPs家族的新成员,具有特异的BIR和 RN G指结构域,可以通过多种途径发挥其抗细胞凋亡作用。Livin与肿瘤的发生、发展、预后和耐药密切相关,并为肿瘤的早期诊断、基因治疗和细胞治疗提供了新的靶点。

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