生乳中L-羟脯氨酸测定方法的研究

■ 赵娟 夏淑鸿 张向荣 刘维华 宁夏兽药饲料监察所

1 前言

2009年，卫生部公布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第二批）》，其中包含生乳中非法添加皮革水解蛋白。皮革水解蛋白是皮革“鞣革”工艺中产生的下脚料，将其掺入到生乳中可以增加蛋白质含量，但会改变生乳的口感及氨基酸的组成，降低生乳中氨基酸的吸收利用率。尤其“鞣革”下角废料中含有的重金属铬，如果被人体吸收蓄积，可导致关节疏松、关节肿大，造成人体重金属中毒。

由于L－羟脯氨酸是动物皮骨的胶原蛋白构成的特征氨基酸，通过水解可以将乳蛋白和其他动物皮骨的胶原蛋白区别开来，因此鉴定L－羟脯氨酸就是鉴定皮革水解蛋白，即检测到了L－羟脯氨酸就证明使用了动物胶原蛋白类产品。

L－羟脯氨酸，又名反式-4-羟基-L-脯氨酸（trans-4-hydroxy-L-proline），分子式C5H9NO3，分子量为131.13。截至2010年5月，“生鲜乳中皮革水解蛋白检测方法”的国家标准或者行业标准均未发布实施。目前，实验室通常参考“乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定方法—比色法”、“生鲜乳中羟脯氨酸的测定—氨基酸分析仪法”、“皮革水解物检测方法—硝酸汞沉淀显色法”进行检测。氨基酸分析仪价格较为昂贵，实验室配备率不高，而紫外分光光度计是实验室常用仪器。本文中，笔者用UV法测定了生乳中L-羟脯氨酸的残留，并进行了方法学考察。

2 试验方法

2.1 主要仪器设备

Shimadzu UV2410pc 紫外分光光度仪；高速冷冻离心机(HITACHI)；N-EVAPTM氮吹仪；移液器（Finnpipette）；CFYQYB YLE-1000水浴锅；GZX-DH-30X35-BS电热恒温干燥箱；具塞玻璃比色管。

2.2 主要试剂

OMEGA-ORACLE L-羟脯氨酸：含量99.5%～101.5%，BIOSZUNE QC DEP提供，批号817k09266；氯胺T（批号20060831）、对二氨基苯甲醛（批号20010103）、盐酸（优级纯，批号20091021）、苯酚（重精馏，批号20100122）均为天津市科密欧化学试剂有限公司生产；柠檬酸、氢氧化钠、结晶乙酸钠、正丙醇均为分析纯；实验用水为去离子水。

2.3 溶液制备

2.3.1 标准溶液的制备

精密称取L-羟脯氨酸对照品50mg置于100mL棕色量瓶中，加水充分溶解并稀释至刻度，摇匀即得L-羟脯氨酸储备液（浓度500μg/mL）；精密量取储备液5mL，置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得L-羟脯氨酸中间液（浓度50μg/mL）。

分别精密量取L-羟脯氨酸中间液0、1.00、2.00、3.00、4.00mL，置100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，得0、0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL的L-羟脯氨酸标准工作液。

2.3.2 试剂配制

氯胺T反应液（临用现配）：由7%的氯胺T水溶液、正丙醇和缓冲液混合而成（20：26：54）；缓冲液：称取5.00g柠檬酸、2.63g氢氧化钠和14.61g结晶乙酸钠溶于水，稀释100mL。显色液（现用现配）：称取10g对二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，缓慢加入65mL异丙醇。

2.4 阳性添加试料的制备

精密量取L-羟脯氨酸储备液（浓度500μg/mL）400μL、1000μL，置于5mL空白生乳样品中，使之成为40μg/mL、100μg/mL的阳性添加试料。

2.5 试料水解

准确量取生乳5mL，置具塞比色管中，加优级纯浓盐酸5mL，加入50g/L的重精馏苯酚水溶液3滴，混匀，靠近液面充入高纯氮气5min；在充氮气状态下封口。将已封口的水解管放在110℃的恒温干燥箱内，水解6h后取出。打开水解管，趁热过滤于100mL容量瓶中，用水反复冲洗试管和滤纸，定容到刻度，混匀。吸取10mL于25mL烧杯中，加10mol/L氢氧化钠溶液8滴，再用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为8.0±0.2，转移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀备用，同时做试剂空白和阳性添加。

图1 L-羟脯氨酸标准工作曲线

图2 L-羟脯氨酸最大吸收峰

2.6 试料的显色

分别移取0、0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL的L-羟脯氨酸标准工作液和待测水解液各5mL。置25mL具塞比色管中，加氯胺T反应液2.00mL，摇匀室温静置20min。再加显色剂2.00mL，摇匀，于60℃恒温水浴20min，-15℃迅速冷却15min，在波长（560±2）nm处测定吸光值，做标准曲线。

2.7 计算

回收率计算公式：R=（Xs－B1）·K/X0·100%。式中，Xs：标准曲线查得添加试料吸光度对应浓度（μg/mL）；X0：阳性添加试料实际浓度（μg/mL）；K：稀释倍数（100）；B1：标准曲线查得空白样品吸光度对应值（μg/mL）。

3 试验结果

3.1 标准曲线

在波长（560±2nm）处测定吸光值，做标准工作曲线。得线性回归方程为：

Conc=4.616X-0.300 R=0.9998

由图1可见，0标准是有一定吸收值的，吸光度与浓度呈良好的线性关系，线性范围为0～2.0μg/mL。

3.2 加标回收率

在空白试料中做40μg/mL、100μg/mL 2个水平阳性添加，每水平做4份平行样品，每份结果取2次平均值，考察4批。生乳中L-羟脯氨酸的回收率、批内变异系数、批间变异系数如表1、2所示。

表1 生乳中L-羟脯氨酸40μg/mL添加结果汇总

表2 生乳中L-羟脯氨酸100μg/mL添加结果汇总

3.3 稳定性

3.3.1 测定时间的影响

对不同浓度的溶液室温放置48h，测定其浓度，考察重复性或稳定性。1h内测定吸光度值变化不显著。结果如表3所示。

表3 显色后放置时间对L-羟脯氨酸待测溶液吸光度的影响

3.3.2 反应液的影响

临用现配和放置许久的氯胺T反应液对测定结果影响较大，结果如表4所示。

表4 氯胺T反应液对L-羟脯氨酸待测溶液吸光度的影响

3.3.3 水解时间的影响

同一空白样品分别制备40和100μg/mL的L-羟脯氨酸阳性添加各9批，分别在110℃的恒温干燥箱内，水解6、12和24h后取出。按2.5、2.6的方法水解显色，测定吸光度值，并比较回收率。结果如表5所示。

表5 同一批样品阳性添加不同水解时间测定L-羟脯氨酸回收率结果

4 分析与讨论

4.1 试样经酸水解，释放出羟脯氨酸，经氯胺T氧化，生成含有吡咯环的氧化物，显色剂中含有的高氯酸破坏了过量的氯胺T，终止氧化。羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长560nm处进行比色，与标准曲线比较可以定量测定L－羟脯氨酸。L－羟脯氨酸是动物皮骨的胶原蛋白构成的特征氨基酸，其含量占10%以上，而乳蛋白中不含有此成分。通过水解可以将乳蛋白和其他动物皮骨的胶原蛋白进行区分，因此鉴定L－羟脯氨酸就是鉴定皮革水解蛋白，即检测到了L－羟脯氨酸就证明使用了动物胶原蛋白类产品。

4.2 由标准曲线得，UV法测定生乳中L-羟脯氨酸含量方法成立，在波长（560±2）nm处有最大吸收（图2），吸光度与浓度呈良好的线性关系，线性范围0～2.0μg/mL；线性回归方程为：Conc=4.616X-0.300，R=0.9998。

4.3 回收率试验结果表明，40μg/mL阳性添加，L－羟脯氨酸平均回收率为100.0%（n=16），回收率范围为87.3%～106.4%，4次考察批内变异系数分别为2.1%、3.6%、2.1%和3.7%，批间变异系数为5.6%；100μg/mL阳性添加，L－羟脯氨酸平均回收率100.4%（n=16），回收率范围为92.7%～107.9%，4次考察批内变系数分别为5.9%、3.6%、4.5%和4.8%，批间变异系数为1.3%。

4.4 稳定性试验表明，用UV法测定生乳中L-羟脯氨酸含量，显色后吸收值测定应在1h内完成，随着放置时间的延长，测定值逐渐减小且不稳定；氯胺T反应液配制后的放置时间对试验结果影响较大，要做到临用现配；生乳酸化水解6、12和24h对L-羟脯氨酸回收率测定结果无显著影响，证明酸化6h可以满足完全水解的目的。另外，不同品牌的标准品和分光光度仪机型可能引起L－羟脯氨酸最大吸收峰的漂移，建议做一定波长范围内的扫描测定，确定吸收峰。因本检测方法所用试剂和步骤较多，生乳空白样品中含有一定量的L-羟脯氨酸，可能由检测过程中使用的各种试剂引入。因此，使用该方法测定回收率时，同时应做样品空白；测定样品时，同时做试剂空白，计算结果时要扣除。

本方法测定生乳中的L-羟脯氨酸含量，检测条件稳定，加标回收率高，变异系数较小，对仪器要求低，应用简单方便。该方法的研究对生乳中皮革水解蛋白鉴定标准的制定修订提供了可靠的实验室数据及科学依据，对质检机构开展生乳质量安全检测工作具有现实指导意义。