丙型肝炎病毒基因型与抗病毒治疗

王自林 宣 艳 王丽莉

自1989年Houghton等发现丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）至今，对HCV基因型与丙型肝炎治疗的研究有了较大的进展。本文对这些问题作一简要的介绍。

一、慢性丙型肝炎的流行状况

丙型肝炎呈全球性流行，并逐年增加，目前全球感染率约为3%，感染者约2亿人[1]，而我国一般人群抗-HCV阳性率为3.2%，有近5千万感染者，属HCV的中高度感染区[2]。丙型肝炎以输血为主要传播途径，其次为手术（包括外科手术、牙科治疗、纹身、美容等）或不洁注射（包括非一次性使用注射器的静脉吸毒）造成的感染或性传播。母婴传播率不超过6%，医务人员注射针头意外刺伤、公共场所共用剃须刀等也可造成散发病例发生[3～7]。在我国2004年制定的《丙型肝炎防治指南》中指出，HCV感染后50%～85%发展为慢性丙型肝炎[8]。有报道，HCV感染后20年，10%～15%发展为肝硬化；HCV相关的肝细胞癌（Hepatoceallualar carcinoma，HCC）的发生率在感染30年后为1%～3%[9，10]。肝硬化和HCC 是慢性丙型肝炎患者的主要死因，其中失代偿期肝硬化最为主要。另外，由于HCV的基因变异性较大，体内产生的中和抗体难以应付不断出现的大量的新的病毒准种，所以丙型肝炎的预防尚无疫苗可用。有报道，有效的抗病毒治疗可改善患者长期生存率与生活质量[11]。因此，积极加强对HCV基因的研究，不断提高治愈率，才能延缓及减少肝硬化和肝癌的发生。

二、HCV的基本分子生物学特性

HCV为黄病毒科单股正链线状RNA，球形，有包膜。基因组全长约 9600 碱基对（bp），由两端非编码区（5′UTR，3′UTR）和中间一个长的开放读码框（Open reading frame，ORF）组成。非编码区序列高度保守，含有核酸的二级结构，5′末端非编码区内有内在性核糖体进入部位（internal ribosomal entry site，IRES），其功能与病毒基因的复制和基因表达的调控有关；而3′UTR对于HCV RNA复制是不可缺少的。ORF编码一个大的前体蛋白，此蛋白可被宿主和病毒蛋白酶加工成结构蛋白（Core、E1、E2和 p7）和非结构蛋白（NS225）。编码区分结构基因区和非结构基因区，结构基因区主要有核心蛋白基因和两个包膜基因。非结构基因有6个，分别为NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[12]。HCV基因组呈现高度异质性，根据HCV基因组核苷酸序列的差异程度，可将HCV分为6种基因型和多种亚型[13]。根据2005年新达成的HCV基因型命名规则共识，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因的亚型，如1a、2b、3c等表示，其中4型中就分为20个亚型。在有些地区，亚型代表了特殊的流行病学价值。因此，在流行病学调查中，为准确地鉴别基因型和亚型，并通过对两个区（E1、NS5B）的序列进行测序和进化树分析来确定基因型/亚型是较为理想的方案。基因型的分布存在地区差异，其中，基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70%以上。在我国，主要为1b和2a，其中以1b型为主，2a型次之。某些地区有1a、2b和3b型的报道；6型主要见于香港和澳门地区，在欧洲和日本以1b型为主，中东地区以4型常见。基因型的意义在于其与抗病毒治疗效果的相关性十分密切。已有研究证明[14]，不同基因型与HCV感染后的病情变化以及干扰素的疗效有一定的相关性，HCV的基因型能影响抗病毒治疗的效果。因此，HCV的基因型是可靠且重要的治疗反应指标。

三、抗病毒治疗的目的

抗病毒治疗的目的是清除或持续抑制体内的HCV，以改善或减轻肝损害、阻止进展为肝硬化、肝功能衰竭或HCC，并提高患者的生活质量。

四、基因型与抗病毒治疗

分子进化分析可以鉴定不同的基因型和基因亚型。基因型、基因亚型和株间的序列异源性分别为30%、20%和10%。HCV基因分型的金标准是包膜区（E1）或非结构基因（NS5B）的序列分析，并与参考序列的比较以及分子进化分析。临床上应用基因特异性寡核苷酸探针或限制性片段长度多态性分析对HCV的NS5B和E1区域进行测序来确定HCV基因分型[15]，两种方法均已标准化，能够测定HCV的6个基因型和一系列亚型，对基因型的检测误差不多，但基因亚型的分型误差约为10%～25%，与所选择测定的基因区（5’NTR）有关。由于只有基因型与临床的关系密切，所以亚型的分型错误对临床影响不大。检测不同基因型的特异性抗体也可以进行基因分型，但不能区别不同的基因亚型，对基因1型的检测效果优于其它基因型。对于血清学方法与分子生物学方法检测结果不一致的感染者，以E1或NS5B区基因的序列分析结果为主。

根据AASLD丙型肝炎防治指南，干扰素和利巴韦林的联合治疗仍然是治疗丙型肝炎的最佳标准方案，可以使多数急性患者和40%以上的慢性患者肝功能长期正常，HCV RNA长期阴性，症状完全消失，达到治愈或接近治愈的效果。影响干扰素疗效的主要因素包括HCV干扰素敏感性决定（ISDR）氨基酸突变数目、血清HCV RNA水平以及肝组织病理学改变程度。对于HCV 1b型和2a型，ISDR突变是患者对干扰素产生持续性应答的预测因素，且随着突变数目的增加，尤其是其特定位点氨基酸（如 2209、2216、2218、2227）的突变，应答率不断升高，但在HCV 1a、3a和2b型中未发现与干扰素疗效有关的氨基酸序列[16，17]。现正开发中的新药物主要有以下几种[18，19]：HCV蛋白酶抑制剂，包括NS2-3蛋白酶和NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂；HCV解旋酶抑制剂；HCV NS5B RNA聚合酶抑制剂；p7离子通道抑制剂，如金刚烷胺；HCV IRES抑制剂，以阻断HCV蛋白的翻译；免疫调节剂，以提高机体的免疫反应如白细胞介素12，或减轻炎症性肝损伤如白细胞介素10。但这些新药物的有效性、安全性以及是否可造成HCV的耐药性变异等方面尚须进一步研究，因而近期内很难应用于HCV感染者的治疗。

荧光定量PCR检测HCV RNA不仅可以在抗-HCV阳转前及时地早期发现感染者，而且能够明确抗-HCV阳性的感染者体内HCV的复制水平，以便确定是否需要进行抗病毒治疗，或预测及评价抗病毒治疗的效果，具有重要的实用价值及临床意义[20]。对于急性丙型肝炎患者予以单剂常规干扰素治疗是有效的。但是，病毒学检测对于决定是否进行干扰素治疗、治疗的剂型、剂量和疗程都没有特殊的价值。HCV基因分型检测在决定疗程方面有重要的意义。干扰素治疗对丙型肝炎相关肝硬化的自然史的影响是肯定的，丙型肝炎抗病毒治疗的目标应该是持续病毒学应答（sustained virus response，SVR），虽然丙氨酸氨基转移酶（ALT）正常和组织学改善也可以改善自然史和临床结局，但ALT和组织学应答仅作为次要指标[21]。多数学者认为HCV 2型感染者对干扰素治疗的反应性比HCV 3型差，治疗前HCV RNA含量低时，治疗反应率高。相反，治疗前HCV RNA含量高时，治疗反应率低，停药半年后HCV RNA仍回升于治疗前的水平，提示治疗前患者HCV RNA的水平可预测干扰素的治疗效果[22]。1型和4型对于聚乙二醇（Peg）干扰素联合利巴韦林标准化治疗较2型和3型更为耐药。Pegα-2α干扰素是将普通干扰素2α与聚乙二醇共价结合而来，peg是一个大分子的线性聚体，能在干扰素分子表面形成一个分子屏障，使其免受酶的分解，稳定性增加，体内清除率减慢。Pegα-2α干扰素的T1/2为96h，药物浓度变动小，消除了普通干扰素的“峰谷”效应，对病毒的抑制作用更持久。Pegα-2α干扰素主要分布在血液和肝脏，并且主要在肝脏代谢，从而发挥最大的治疗效应[23]。同时由于Peg的分子屏障作用，减少了中和抗体的生成，降低了过敏反应，具有更优越的安全性。两个大型临床注册试验评估Pegα-2α干扰素联合利巴韦林治疗初治患者总的SVR为60%[24]。以下情况可优先考虑应用聚乙二醇干扰素治疗：（1）在既往治疗中对普通干扰素无效或治疗后复发者；（2）对难治病例（病毒载量＞2×106copies/m l，基因 1 型，年龄＞50岁，男性，代偿期肝硬化或者酗酒者）；（3）普通干扰素治疗12周HCV RNA载量未下降或下降幅度小于＜2log者。现在利巴韦林被批准用于治疗慢性丙型肝炎只能在干扰素联合治疗方案中应用[25]。

疗程的判断应根据患者的不同情况确定。理论上讲，对治疗有效者，疗程越长，持续应答率越高，以HCV基因型和治疗中HCV RNA下降速度最为重要。对基因型2、3型患者：（1）在治疗4周或12周时血清HCV RNA阴性者，6个月疗程可使60%以上患者获得持续性应答；（2）对治疗12周HCV RNA未转阴但下降幅度＞2log者，为达到持续应答，疗程需要延长至12个月；（3）在以往治疗中，疗程为6个月但复发者，疗程应该延长至12个月；（4）病毒载量＞2×106copies/ml，年龄＞50岁，男性，肝硬化（代偿期）或者酗酒者，疗程也应当延长至12个月。对基因1型的患者，标准疗程为联合治疗12个月，如果病毒清除延迟（HCV RNA在12～24周转为阴性），应考虑将治疗时间延长到72周[26]。

基因型的测定有助于决定疗程和利巴韦林用量。基因2、3型感染仅需要治疗24周，利巴韦林用量为800mg/d即可达到70%～80%的持续病毒学应答。而基因1型感染需要48周疗程，利巴韦林用量应达到1000～1200mg/d，即使采用长效干扰素和利巴韦林进行48周的联合治疗，1型HCV感染者的SVR也仅有40%～50%[27]。我国临床试验结果表明，PEG-干扰素α-2a24周单药治疗慢性丙型肝炎患者的SVR为41.5%，其中基因1型患者为35.4%，非基因1型患者为66.7%[28]。马烈等[29]报道基因1型患者复发率为54.5%，非1型患者复发率为32.1%。

资料还表明，12周时的早期病毒学应答（early virus response，EVR），即HCV RNA载量下降2个对数值或在检测水平100copies/mL，可预测停药后24周的SVR，具有较好的临床意义[26]。HCV RNA测定对基因2、3型感染者意义不大，治疗结束时HCV RNA阴性提示获得病毒学应答，应在24周再次检测以评价其持续应答，而治疗结束时HCV RNA仍然阳性则可能出现复发。基因1型感染者接受聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗时，在治疗前和12周时测定HCV RNA可以评价早期病毒学应答，12周时HCV RNA下降2个对数值或者阴性者应继续治疗至48周，如果未获得早期病毒学应答，即使治疗48周，获得持续性病毒学应答的几率也很低。

[1]SURIAWINATA A，XU R.An update on the molecular geneties of hepatocellular carcinoma[J].Semin Liver Dis，2004，24：77-78.

[2]刘妲妲，王全楚.输血后丙型肝炎患者的临床特点及自然病程[J]. 实用肝脏病杂志，2008，11（6）：410-411.

[3]OLIZZOTTO MN，WOOD EM，INGHAM H，et al.Reducing the risk of transfusion-transmissible viral infection through blood donor selection：the Australian experience 2000 through 2006[J].Transfusion，2008，48（1）：55-63.

[4]QIU Y，SHI L，WANG Y，et al.Risk factors for hepatitis C virus infection among blood donors in Beijing and implications for improving the pretesting donor screening pocess[J].Transfusion，2008，48（6）：1207-1212.

[5]THONGSAWAT S，MANEEKARN N，KUNIHOLM MH，et al.Occult hepatitis C virus infection during an outbreak in a hemodialysis unit in Thailand[J].JMed Virol，2008，80（5）：808-815.

[6]TAYLOR A，HUTCHINSON SJ，GILCHRIST G，et al.Prevalence and determinants of hepatitis C virus infection among female drug injecting sex workers in glasgow[J].Harm Reduct J，2008，5（1）：11.

[7]PALMATEER N，ANDERSON N，WADD S，et al.Exploring associations between perceived HCV status and injecting risk behaviors among recent initiates to injecting drug use in glasgow[J].Subst Use Misuse，2008，43（3）：375-388.

[8]中华医学会肝病学会和传染病与寄生虫病学分会.丙型肝炎防治指南[J].实用肝脏病杂志，2004，7：1-6.

[9]SEEFF LB.Natural history of chronic hepatitis C[J].Hepatology，2002，36：S35-46.

[10]FATTOVICH G，GIUSTINA G，DEGOS F，et al.Morbidity and mortality in compensated cirrhosis type C：a retrospective follow-up study of 384 patients[J].Gastroenterology，1997，112：463-472.

[11]JOHN-BAPTISTE AA，TOMLINSON G，HSU PC，et al.Sustained responders have better quality of life and productivity compared with treatment failures long after antiviral therapy for Hepatitis C[J].Am JGastroenterol，2009，04（10）：2439-48.

[12]KANG SM，CHOI SH，PARK CY，et al.Monoclonal antibody recognizing N2terminal epitope of hepatitis C virus non-structural 5B inhibit s viral RNA replication[J].J Viral Hepat，2008，15（4）：305-313.

[13]MORATORIO G，MARTINEZ M，GUTIERREZ MF，et al.Evolution of naturally occurring 5′non-coding region variant s of Hepatitis C virus in human populations of the South American region[J].Virol J，2007，4（1）：7-9.

[14]高玉红，李峥，台虹.丙型肝炎病毒基因分型方法研究进展[J]. 国际检验医学杂志，2006，27（10）：908-910.

[15]于建武，赵勇华，李树臣.丙型肝炎病毒血清型对慢性丙型肝炎患者早期病毒学应答和生化应答的影响[J].肝脏，2007，12（1）：8.

[16]KOHASHI T，MAEKAWA S，SAKAMOTO N，et al.Site-specific mutation of the interferon sensitivity-determining region（ISDR） modulates hepatitis C virus replication[J].J Viral Hepat，2006，13（9）：582-590.

[17]UKAI K，ISHIGAMI M，YOSHIOKA K，et al.Mutations in carboxy-terminal part of Eincluding PKR/eIF2αphosphorylation homology domain and interferon sensitivity determining region of nonstructural 5A of hepatitis C virus 1b：Their correlation with response to interferon monotherapy and viral load[J].World JGastroenterol，2006，12（23）：3722-3728.

[18]TAN SL，PAUSE A，SHI Y，et al.Hepatitis C therapeutics：current status and emerging strategies[J].Nat Rev Drug Discov，2002，1（11）：867-881.

[19]DE FRANCESCO R，RICE CM.New therap ies on the horizon for hepatitis C：are we close[J].Clin LiverDis，2003，7（1）：211-242.

[20]姚海云，房桂青，韩雪莹.丙型肝炎患者血清HCV RNA定量与抗-HCV检测效果分析[J].中国输血杂志，2008，21（7）：535.

[21]ASIAN PACIFIC ASSOCIATION FOR THE STUDY OF THE LIVER（APASL） HEPATITIS C WORKING PARTY，MCCAUGHAN GW，OMATA M，et al.Asian Pacific Association for the Study of the Liver consensus statements on the diagnosis，management and treatment of hepatitis C virus infection[J].J Gastroenterol Hepatol，2007，22（5）：615-33.

[22]郭振华，陈青锋，肖萍，等.HCV基因分型与干扰素疗效相关性探讨[J]. 临床检验杂志，2008，26（4）：306.

[23]GLUE P，FANG JW，ROZIER-PANIS R，et al.Pegylated interfon alfa-2b：Pharmacokinetics，pharmacodynamics，safety and Preliminary efficaly data[J].Clin Pharmacol Ther，2000，68：556-567.

[24]MANNSMP，MCHVTCHISON JG，GORDON SC，et al.Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C：a randomized trial[J].Lancet，2001，358：958-965.

[25]FELD JJ，HOOFNAGLE JH.Mechanism of action of interferon and ribavirin in treatment of hepatitis C[J].Nature，2005，436：967-972.

[26]GHANY MG，STRADER DB，THOMAS DL，et al.AASLD PRACTICE GU IDEL INES：diagnosis，management，and treatment of hepatitis C：an update[J].Hepatology，2009，49（4）：1335-1374.

[27]FRIED MW，SHIFFMAN ML，REDDY R，et al.Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection[J].N Engl JMed，2002，347：975-982.

[28]徐道振，谢尧，陆志檬，等.聚乙二醇干扰素a-2a与干扰素a-2a治疗慢性丙型肝炎疗效、安全性的评估[J].中华传染病杂志，2004，22：221-224.

[29]马烈，赵辉，谢尧，等.干扰素治疗慢性丙型肝炎的持续应答与复发相关因素的研究[J].中华肝脏病杂志，2006，4：565-568.