端粒和端粒酶在乙型肝炎、肝硬化和肝癌中的研究现状*

王丽华 综述 朱传武 陈 明 审校

端粒是真核细胞染色体末端的重要结构，端粒酶是维持端粒长度的RNA依耐性DNA聚合酶。近年来，在基础和临床研究方面对端粒和端粒酶进行了大量的研究，并取得了较大的进展，现综述如下。

一、端粒的结构与功能

端粒是线性染色体末端的核蛋白结构，其功能是防止染色体发生末端融合和重组。在大多数器官里，端粒DNA是富含鸟苷酸的简单串联重复序列（TTAGGG），四个TTAGGG重复序列折叠成一个G-四倍体。对于端粒酶而言，这是一个惰性底物，这种特性不但为抑制端粒酶的活性提供了分子机制，而且更多地影响了端粒的功能[1]。端粒被六种核心蛋白TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、TIPP1 和 POT1 组成的复合物所保护，这种复合物称为屏障因子，有助于防止端粒被作为DNA双链缺口加以识别，发生同源重组和非同源重组并进行不恰当的修复[2]。端粒DNA最末端为一3’端单链突出物，称之为G尾。在哺乳类动物细胞里，这种突出物能侵入端粒最近的区域形成一个特别的D环。重要的蛋白通过DNA与蛋白、以及蛋白与蛋白的相互作用募集到端粒上。

在缺乏端粒酶延长机制时，由于传统的DNA聚合酶不能复制端粒，故随着细胞的不断分裂端粒DNA逐渐丢失。有研究[3，4]表明，单链端粒的缺失足以生成至少两种早期癌细胞表型。同时，癌细胞通过激活端粒自我平衡程序获得无限或非常大的增殖潜力。细胞培养模型研究显示，复制衰老和端粒耗损有密切的关系，年长者端粒长度较年轻者为短，但体内端粒缩短对人类老化的影响还难以证明，包括端粒功能障碍对年龄相关的病理变化也是如此。

细胞在进化过程中已经形成对抗端粒DNA逐渐丢失的机制。在某些器官，端粒以重组的方式维持端粒长度。在另外一些器官，端粒的长度由端粒酶合成。在某些癌组织中检测不到端粒酶，这些癌细胞使用一种非传统的端粒延长（alternative lengthening of telomeres，ALT）方式来维持端粒长度[3]。Gatbonton等[5]发现在酵母菌中，删除72个基因可致短端粒，而有80个基因是与野生型酵母菌的长端粒有关的。他们还发现有39个基因对端粒酶缺乏细胞的增殖或端粒长度维持起重要作用，包括参与脱氧核苷酸的生物合成，姐妹染色质的黏附，空泡蛋白分类等。

二、端粒酶的结构与功能

在细胞复制期间，由于端粒DNA末端不能复制，因此端粒长度进行性缩短。为了避免端粒过度缩短导致细胞复制终止，真核细胞在进化中形成了一种特殊逆转录酶——端粒酶，其功能是通过将DNA重复序列添加到染色体的3’末端以对抗端粒的持续降解。端粒酶是一种高度特异化核蛋白复合物，为端粒DNA延长提供RNA模板序列[6]，包括两个基本核心成分，端粒酶逆转录酶或称为端粒酶催化亚单位（telomerase reverse transcriptase，TERT） 和端粒酶 RNA（telomerase RNA，TR），以及几个端粒酶相关辅助蛋白。具有催化活性的TERT蛋白使用TR成分中的短序列作为模板合成端粒DNA。人类端粒酶RNA成分包括了451个核苷酸，5’端一半折叠入保守的催化核心，组成了模板区域和附近的假结节区域[7]。TR的大小因物种的不同而差异显著，纤毛虫150个核苷酸（nt），脊椎动物556nt，酵母菌超过 1500nt。人们应用种系对比分析法为每个物种建立了TR二级结构模式。从纤毛虫、酵母到脊椎类生物，TR结构共享一个模板区域附近相似的假结节结构。Feng等[8]研究发现，S.cerevisiae TLC1RNA核心区域包含了一个保守的三级螺旋结构，这种三级螺旋结构的降解造成了体外端粒酶活性的下降和体内端粒的缩短，并且与蛋白亚单位的结合力没有改变。同时发现，三级螺旋结构接近端粒引物的3’末端与模板绑定。端粒酶RNAs三级螺旋区域的一个或多个2'-OH对催化起重要作用。Shefer等[9]在体外用用寡聚核苷酸证实了三级螺旋结构的形成，而且证实其对端粒酶的功能是必需的。但是，三倍体干扰突变废除了端粒酶的功能，G-CC三倍体的补偿突变以pH依赖的方式恢复假结节结构，并且部分恢复体内端粒酶功能。另外，一种新类型的G-CU三级螺旋结构，也能部分恢复假结节的结构和功能。Yu等[10]研究发现，纤毛端粒酶RNA基本功能结构域是四级茎环结构，可强烈地刺激端粒酶活性和转录加工过程。通过大量结构和功能的研究，发现这些结构特征和酶的活性残基对TERT蛋白结合没有明显的影响。有研究[11]表明，Kluyveromyces lactis TER的5’臂对端粒酶功能起关键作用，它可能与Est3的功能有关。

David等[12]研究证实，基本的端粒DNA结合蛋白Cdc13p对芽殖酵母的端粒长度具有双向调节作用，他们发现Cdc13p通过三种完全不同的方式抑制端粒酶的活性，包括一种新的远距离的抑制方式。Zhang等[13，14]发现以前参与端粒长度调节的异源性核蛋白A1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，hnRNPA1）结合到DNA单链和具有人端粒重复序列的结构，扰乱了单链和端粒的高级结构。应用体外端粒酶实验，观察到hnRNPA A/B蛋白显著下调了端粒酶活性，加入纯化的重组hnRNPA可增加端粒酶活性。研究表明hnRNPA1的功能是作为端粒酶全酶的辅助因子而非必需因子。进一步研究发现，hnRNPA1与体内端粒有联系，认为hnRNPA1通过每次转位步骤中形成的G四级结构或G-G发夹结构的松解刺激端粒延长，G-四倍体是富含鸟苷酸的DNA序列。尽管在大多数成人体细胞中端粒酶处于失活状态，但是在90%的人类癌症细胞中会被再激活，并且端粒酶对端粒长度的维持是导致这些细胞持续增殖的重要机制。

三、端粒、端粒酶与免疫应答

典型的免疫应答依赖于两种功能淋巴细胞，即T细胞和B细胞。免疫应答起始于T淋巴细胞和B淋巴细胞对抗原的识别和结合，并导致特异性淋巴细胞的大量扩增。淋巴细胞的端粒缩短到一定长度，无论发生在单倍体还是多倍体染色体末端，细胞均停止分裂并且衰老死亡或发生凋亡。端粒具有计数细胞分裂次数的功能并限制了正常体细胞分裂的次数。最近研究表明[15]，衰老的细胞与新生的细胞相比，端粒明显缩短，一方面是由于细胞分裂后，累积的端粒缩短，另一方面是由于端粒酶活性的缺乏或不足，表明端粒在决定这些细胞的复制寿命上起重要作用。从初始T细胞分化为记忆细胞经历多次细胞分裂导致端粒重复序列的缩短，然而这种累积的端粒缩短是否最终影响记忆T细胞的功能现在还不明确。在T细胞分化和分裂过程中，端粒损耗的速率也不清楚。T细胞端粒酶表达研究表明，在T细胞发育和分化过程中端粒酶活性明显上调。随着每个周期刺激后体外T细胞增殖能力下降，激活T细胞端粒酶的活性也下降。在初始B细胞分化为记忆B细胞的过程中，端粒长度没有明显丢失。与T细胞一致的是，在静止的B细胞端粒酶并不表达，但在丝裂原刺激后酶的活性则迅速激活。结果表明在B细胞分化过程中，端粒酶的活性不仅能够被调节，而且能够延长体内端粒长度。

四、乙型肝炎患者外周血淋巴细胞人TERT（hTERT）的表达

在淋巴细胞发育、分化和激活过程中，端粒酶活性及TERT的表达明显上调，表明端粒酶在控制淋巴细胞复制寿命中的潜在作用。淋巴细胞端粒缩短被认为是免疫衰老的标志，如果端粒酶阻止淋巴细胞端粒缩短，则对免疫功能，器官老化和癌症的发生均起重要作用。HBV感染的外周血淋巴细胞，包括免疫细胞的选择和T淋巴细胞凋亡的增加导致了免疫应答受损。在慢性HBV感染患者的研究中，宿主免疫功能障碍可能与hTERT有关。因此，患者外周血淋巴细胞中hTERT的表达受到了高度重视。

无论端粒酶活性如何，人类TR在所有组织均会高表达，但只有hTERT mRNA的表达与端粒酶的活性密切相关。上调淋巴细胞端粒酶的活性，可能会有效阻止分裂中的淋巴细胞发生端粒缩短，保证淋巴细胞持续增殖。如果端粒酶活性很低，淋巴细胞则不断发生端粒缩短。因此，淋巴细胞端粒酶活性下降会影响宿主的免疫功能，这已在HIV感染的患者中得到了证实[16]，说明人类淋巴细胞端粒长度、端粒酶活性与宿主的免疫功能有关。另有研究发现[17]，HBV感染患者外周血淋巴细胞中hTERT mRNA表达比正常对照人群显著下降，而hTERT mRNA的水平与端粒酶的催化活性密切相关，因此提示端粒酶可能间接参与了慢性乙型肝炎的免疫病理损伤。在慢性乙型肝炎患者中，hTERT mRNA转录表达的下降与患者的临床状态、年龄、性别或者丙氨酸氨基转移酶水平无关，但其病程与hTERT mRNA的水平呈负相关。研究结果表明，慢性乙型肝炎患者淋巴细胞中较低水平的hTERT mRNA表达与慢性肝炎的免疫病理有关，这也反映了免疫系统的过早衰老，因此可能与慢性乙肝中肝癌的高发病率有关。

五、肝硬化和肝癌中端粒酶及hTERT的变化

Yao等[18]研究了端粒酶在肝癌发生中的动态变化，以及端粒酶在肝组织和外周血单个核细胞中的表达对肝癌的诊断意义。发现在肝癌的发展过程中端粒酶是呈动态变化的，在肝细胞的退化、癌前病变和癌化的各个阶段，端粒酶的活性和肝脏总RNA水平一致。在肝癌患者肝组织中端粒酶水平较癌旁组织明显增高。以较低的吸光度评价，正常对照、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌组中外周血端粒酶的阳性率分别是15.7%、25%、45.9%和85.2%。如以较高的吸光度评价，则肝癌组为60%，而其他组均为0。将外周血端粒酶和血清AFP水平相结合可显著增加肝癌诊断的阳性率和准确度。因此，端粒酶的过度表达与肝癌的发生有关，可作为肝癌的诊断标志。

有学者[19]用实时定量RT-PCR检测了hTERT mRNA转录水平、实时PCR与Southern blot检测了hTERT、c-myc mRNA的基因表达水平。共检测了44例肝脏结节，包括5个再生结节，14个低等级发育不良结节，7个高等级发育不良结节，11个肝癌病灶的不良增生结节，17个肝癌病灶和23个慢性肝炎或肝硬化肝脏组织，6个正常肝组织。结果发现，hTERT mRNA水平随肝癌发生的进展而增加，大多数高等级结节所表达的hTERT mRNA与肝癌组织类似。有21%的低等级结节具有较高水平的hTERT mRNA，接近于高等级结节的水平，但在低等级结节中hTERT mRNA水平的高低与病理特征无关。提示检测hTERT mRNA可以发现肝脏结节的癌化趋势，肝癌发生时hTERT和c-myc mRNA的基因表达不是调节hTERT mRNA转录的主要机制。

六、HBV蛋白与hTERT mRNA变化的关系

Guo等[20]用免疫组化检测30例HBsAg阳性和17例HB－sAg阴性原发性肝癌中hTERT蛋白表达，用RT-PCR法分析hTERT mRNA表达的情况，结果发现：hTERT蛋白主要分布于肝癌细胞胞质，偶尔分布于胞核。HBsAg阳性患者hTERT蛋白及其mRNA的阳性率分别是93.33%和83.33%，而HBsAg阴性患者hTERT蛋白及其mRNA的阳性率分别是 52.94%和 47.06%。表明在人肝癌细胞中，HBsAg与hTERT mRNA的表达是相关的，HBV的蛋白成分可能通过激活hTERT基因在肝细胞转化和癌症发生过程中起重要作用。另一项研究通过将HBV X基因转染到人类肝癌细胞系和胆管癌细胞后，其hTERT mRNA表达上调，表明HBx基因能上调hTERT mRNA转录，HBx基因所致的hTERT基因激活可能是HBV感染患者肝癌和胆管癌发生的分子机制之一[21]。

Zhang等[22]检测了34例肝癌和相应癌旁组织，30例肝硬化和6例正常肝组织，发现肿瘤组织、癌旁组织和硬化肝组织中hTERT的阳性率分别为67.6%、73.5%和100%，但在正常肝组织中未发现hTERT呈阳性。在肿瘤组织中HBsAg、HBcAg和HBxAg的阳性率分别为58.8%、26.5%和76.5%；在癌旁组织中的阳性率分别为64.7%、41.2%和85.3%；在硬化肝组织中分别为76.7%、66.7%和100%。结果显示，hTERT表达和这些组织中HBxAg的表达无显著差异。Western-blot分析显示，在HBx基因短时转染的肿瘤细胞中，c-myc和hTERT的表达比对照组要高得多；用靶区扩增多态性（TRAP）方法检测端粒酶的活性，也得出了类似的结果。研究表明HBx上调了肝肿瘤细胞hTERT的表达，并与肿瘤的发展有关。

七、hTERT mRNA检测的临床意义

血清中hTERT mRNA可以作为一种新的肿瘤标志。Miura等[23]检测了64例肝癌、20例肝硬化、20例慢性肝炎和50例健康个体血清hTERT mRNA水平，结果发现肝癌比慢性肝病患者具有更高的血清hTERT mRNA水平，hTERT mRNA的表达与肿瘤面积、数量和分化程度等变量呈现独立相关关系。在诊断肝癌方面，hTERT mRNA的敏感性和特异性分别是88.2%和70.0%，而AFP mRNA分别是71.6%和67.5%。由于血清与肝癌组织中的hTERT mRNA是相关的，因此血清hTERT mRNA比AFP mRNA对肝癌的诊断更具优越性，可以作为一种新的、有价值的肿瘤诊断标志物。

[1]TANG J，KAN ZY，YAO Y，et al.G-quadruplex preferentially forms at the very 3'end of vertebrate telomeric DNA[J].Nucleic Acids Res，2008，36（4）：1200-1208.

[2]GUO X，DENG Y，LIN Y，et al.Dysfunctional telomeres activate an ATM-ATR-dependent DNA damage response to suppress tumorigenesis[J].EMBO J，2007，26（22）：4709-4719.

[3]TITEN SW，GOLIC KG.Telomere loss provokes multiple pathways to apoptosis and produces genomic instability in Drosophila melanogaster[J].Genetics，2008，180（4）：1821-1832.

[4]BLAGOEV KB.Cell proliferation in the presence of telomerase[J].PLoS One.2009，4（2）：e4622.

[5]GATBONTON T，IMBESIM，NELSON M，et al.Telomere length as a quantitative trait：genome-wide survey and genetic mapping of telomere length-control genes in yeast[J].PLoS Genet，2006，2（3）：e35.

[6]MORRISH TA，GREIDER CW.Short telomeres initiate telomere recombination in primary and tumor cells[J].PLoS Genet，2009，5（1）：e1000357.

[7]GAVORY G，SYMMONS MF，KRISHNAN GHOSH Y，et al.Structural analysis of the catalytic core of human telomerase RNA by FRET and molecular modeling[J].Biochemistry，2006，45（44）：13304-13311.

[8]QIAO F，CECH TR.Triple-helix structure in telomerase RNA contributes to catalysis[J].Nat Struct Mol Biol，2008，15（6）：634-640.

[9]SHEFER K，BROWN Y，GORKOVOY V，et al.A triple helix within a pseudoknot is a conserved and essential element of telomerase RNA[J].Mol Cell Biol，2007，27（6）：2130-2143.

[10]CHEN Y，FENDER J，LEGASSIE JD，et al.Structure of stem-loop IV of tetrahymena telomerase RNA[J].EMBO J，2006，25（13）：3156-3166.

[11]KABAHA MM，ZHITOMIRSKY B，SCHWARTZ I，et al.The 5′arm of kluyveromyces lactis telomerase RNA is critical for telomerase function[J].Mol Cell Biol，2008，28（6）：1875-1882.

[12]ZAPPULLA DC，ROBERTS JN，GOODRICH KJ，et al.Inhibition of yeast telomerase action by the telomeric ssDNA-binding protein，Cdc13p[J].Nucleic Acids Res，2009，37（2）：354-367.

[13]ZHANG QS，MANCHE L，XU RM，et al.HnRNP A1 associates with telomere ends and stimulates telomerase activity[J].RNA，2006，12（6）：1116-1128.

[14]PATEL DJ，PHAN AT，KURYAVYI V.Human telomere，oncogenic promoter and 5′-UTR G-quadruplexes：diverse higher order DNA and RNA targets for cancer therapeutics[J].Nucleic Acids Res，2007，35（22）：7429-7455.

[15]WENG NP.Telomere and adaptive immunity[J].Mech Ageing Dev，2008，129（1-2）：60-66.

[16]REYNOSO R，MINCES L，SALOMON H，et al.HIV-1 infection downregulates nuclear telomerase activity on lymphoblastoic cells without affecting the enzymatic components at the transcriptional level[J].AIDS Res Hum Retroviruses，2006，22（5）：425-429.

[17]SATRA M，DALEKOS GN，KOLLIA P，et al.Telomerase reverse transcriptase mRNA expression in peripheral lymphocytes of patients with chronic HBV and HCV infections[J].J Viral Hepat，2005，12（5）：488-493.

[18]YAO DF，WU W，YAO M，et al.Dynamic alteration of telomerase expression and its diagnostic significance in liver or peripheral blood for hepatocellular carcinoma[J].World JGastroenterol，2006，12（31）：4966-4972.

[19]OH BK，KIM YJ，PARK YN，et al.Quantitative assessment of hTERT mRNA expression in dysplastic nodules of HBV-related hepatocarcinogenesis[J].Am J Gastroenterol，2006，101（4）：831-838.

[20]GUO Y，ZHOU X，LIU E，et al.Difference in hTERT gene expressions between HBsAg-positive and HB－sAg-negative hepatocellular carcinoma[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2005，25（3）：303-306.

[21]QU ZL，ZOU SQ，CUI NQ，et al.Upregulation of human telomerase reverse transcriptase mRNA expression by in vitro transfection of hepatitis B virus X gene into human hepatocarcinoma and cholangiocarcinoma cells[J].World JGastroenterol，2005，11（36）：5627-5632.

[22]ZHANG X，DONG N，ZHANG H，et al.Effects of hepatitis B virus X protein on human telomerase reverse transcriptase expression and activity in hepatoma cells[J].J Lab Clin Med，2005，145（2）：98-104.

[23]MIURA N，MAEA Y，KANBE T，et al.Serum human telomerase reverse transcriptase messenger RNA as a novel tumor marker for hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res，2005，11（9）：3205-3209.