中药补髓健脑方对帕金森小鼠模型行为学及脑内一氧化氮含量的影响

程为平,董升平,马莉,赵吉诺,张洋

(黑龙江中医药大学附属第一医院神经内科,哈尔滨 150040)

帕金森病(PD)又称震颤麻痹,是一种多发于中老年人的慢性神经系统退行性疾病,病理特征为黑质细胞变性坏死,脑内神经递质多巴胺的生成、代谢障碍[1-2],主要表现为震颤,肌肉僵直,运动活动-启动困难和姿势反射丧失等[3]。造成以多巴胺能系统与胆碱能系统为主的脑内多个神经递质之间的不平衡。左旋多巴类制剂为治疗 PD的主要药物[4],但长期应用会导致疗效递减。为了探讨中药治疗PD的疗效和机制,我们采用 PD小鼠模型进行以下研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 健康 10～11周龄 C57BL/6雄性小鼠 60只,体质量(20±2)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。室内常温下配方料喂养,自由饮食水。

1.1.2 仪器 电热恒温水浴箱(RF-540型,江苏);电动玻璃匀浆机(DY89-1型,宁波);分析振荡器(FZQ-2型,江苏);托盘式扭力天平(TN-100B型,上海);电动离心机(LD5-2型,北京);722光栅分光光度计(上海第二分析仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法 采用腹腔注射 MPTP的方法制备 PD动物模型。将 60只小鼠随机分为空白组、模型组、中药组及美多巴组。模型组、中药组和美多巴组给予 1-甲基 -4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)腹腔注射(0.03mg/g体质量),1次/d,连续 7 d制备PD小鼠模型;空白组给予 0.9%氯化钠注射溶液腹腔注射。

1.2.2 治疗方法 实验第 8天开始,中药组予补髓健脑方灌胃,0.1 ml/g(每毫升含有生药量1.2mg),1次/d,连续 14 d;美多巴组给予美多巴悬浊液灌胃(0.12 mg/g体质量),1次 /d,连续 14 d;空白组和模型组给予等量 0.9%氯化钠注射溶液腹腔注射。

1.2.3 行为学测试方法 各组小鼠于实验前 5天每日进行 2次爬杆、悬挂行为训练。分别于实验前1天(首次注射 MPTP前 1天),第 7天(注射药物后1小时),第 14天和第 21天上午 10:00(针刺后1 h)进行爬杆[5]和悬挂[6]实验以检测其肢体运动协调能力。

将一直径为 2.5 cm的泡沫塑料小球固定于一根长 60 cm粗 1 cm的木杆顶端,木杆上缠 2层纱布以防打滑。将小鼠放到球顶,分别记录小鼠爬完杆长的上半部分、下半部分及全长所需的时间。3 s内完成上述某一动作记 3分;6 s内完成记 2分;超过6 s记 1分 。

将小鼠双前肢悬挂于一水平电线上,如小鼠用双后肢抓住电线记 3分;仅用一只后肢抓住电线记 2分;两只后肢均抓不住记 1分;小鼠跌落记为 0分。

1.2.4 脑内 NO含量的检测 行为学测试后,将小鼠断头取脑,经视交叉处冠状切开,向后取约 3 mm厚脑组织,用冰 0.9%氯化钠注射溶液漂洗后,滤纸拭干,称重后加入 9倍冷 0.9%氯化钠注射溶液。电动匀浆机中研磨成 10%匀浆,以 1 000～2 000 r/min离心 10 m in,取上清液,再以 8 000～1 0000 r/min离心 15 min,取上清液,分别按 NO试剂盒说明检测其含量。

1.3 统计学处理 应用 SPSS软件,采用 t检验。

2 实验结果

2.1 行为学实验结果 实验前一天观察小鼠爬杆及悬挂行为,模型组、中药组和美多巴组小鼠实验评分分别与空白组相比,无差异(P＞0.05、P＞0.05、P＞0.05);实验第 7天、第 14天和第 21天观察模型组小鼠,其实验评分明显降低,分别与空白组相比差异显著(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01),提示造模成功;实验第 14天和第 21天中药组和美多巴组小鼠实验评分明显升高,分别与模型组相比差异显著(P＜0.05、P＜0.01),说明中药对 PD小鼠有治疗作用。实验第 14天和第 21天中药组与美多巴组小鼠悬挂实验评分相比,无差异(P＞0.05、P＞0.05),见表 1,2。

表1 各组小鼠实验前后爬杆实验评分(±s,分)

表1 各组小鼠实验前后爬杆实验评分(±s,分)

注:与空白组比较,aP＜0.01,b P＜0.05;与模型组比较,c P＜0.05;与中药组比较,d P＞0.05

组别 鼠数(只)实验前 1天 第 7天 第 14天 第 21天空白组 15 6.50±1.15 6.67±1.21 6.61±0.98 6.56±0.96模型组 15 6.30±1.28 4.41±1.21a 5.24±1.20b 5.49±0.79b中药组 15 6.71±1.13 4.78±0.21a 6.69±1.05c 6.82±1.20c美多巴组 15 6.79±1.24 4.67±0.21a 6.32±1.14cd 6.45±0.74cd

2.2 生化指标检测 模型组小鼠脑内 NO含量(6.62±0.49μmol/gprot)明显增多,与空白组(3.36±0.40μmol/gprot)相比差异有统计学意义(P＜0.01);中药组(3.67±0.21μmol/gprot)与模型组相比,小鼠脑内NO含量明显减少(P＜0.01);美多巴组(3.25±0.54μmol/gprot)与模型组相比,小鼠脑内 NO含量明显减少(P＜0.01);中药组和美多巴组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组小鼠实验前后悬挂实验评分(±s,分)

表2 各组小鼠实验前后悬挂实验评分(±s,分)

注:与空白组比较,aP＜0.01,c P＜0.05;与模型组比较,d P＜0.01,e P＜0.05;与中药组比较,b P＞0.05

组别 鼠数(只)实验前 1天 第 7天 第 14天 第 21天空白组 15 2.05±0.74 2.09±0.89 1.99±0.83 1.97±0.75模型组 15 1.84±0.96 0.81±0.13a 0.94±0.27c 0.95±0.12a中药组 15 2.06±1.01 0.89±0.26a 2.01±0.34d 2.03±0.48d美多巴组 15 2.21±0.85 0.71±0.25ab 1.94±0.29eb 2.07±0.71db

3 讨论

3.1 中药对 PD模型动物行为学的影响 运动障碍是帕金森病患者的主要临床表现,运动障碍往往同时伴随运动协调能力降低及肌张力增高,包括运动不能、运动减少、运动迟缓。实验中,我们采用爬竿和悬挂实验检测帕金森小鼠的运动和协调功能障碍。研究发现中药能够显著缩短小鼠爬杆时间,增强小鼠附着能力,提示中药能够提高动物模型肢体运动和协调能力,推测其对 PD的症状具有改善作用。

3.2 中药治疗 PD的机制 帕金森病属于中医的颤证范畴[7],《医学纲目》曰:“掉即颤振之谓也”并首先提出“颤振”曰“颤,摇也;振,动也”。古人对颤证病因观察十分细致[8],本病属于本虚标实之证,本虚在肝肾阴虚,气血不足,髓海空虚。标实为风,火,痰,瘀,上犯清空,脑神失司。综上,组天元冲剂:肝筋亏虚,虚风内动则颤,阴血不足,筋脉失荣则痉。本方由首乌、黄精、天麻、葛根、元胡、当归和石斛等药组成。其中天麻、葛根可熄风止痉[9];元胡与当归相配行气止痛;首乌与黄精相配可补髓荣筋,石斛可益智健脑。诸药相伍共奏止颤熄风、活血开窍之功。

PD的主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺(DA)能神经元的进行性变性坏死,目前认为可能与自由基、氧化反应增强等因素有关,当自由基无法正常被清除而在机体内过度堆积后,就会引起脂质过氧化等一系列损害反应,导致氧化应激的发生[10]。NO也是一种自由基,其与超氧阴离子(O-2)结合形成氧化亚硝酸离子,后者可以使线粒体的呼吸功能受到抑制,并可能损伤 DA能神经元或分解成 OH-自由基,产生细胞毒性作用,使损伤进一步加重[11]。

本实验表明,中药补髓健脑方可以降低 PD小鼠模型脑内 NO含量,从而改善自由基的代谢,减少神经元的损伤和神经毒性,减少其凋亡、坏死,进而达到保护黑质内神经元,抗氧化应激等目的,缓解PD的进程。

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