m icroRNA在大鼠急性心肌梗死模型的差异表达及其功能分析

施冰,米林,王娟,崔庆华,郭艳红,于海弈,高炜

(1.北京军区总医院干部病房一科,北京 100700;2.北京大学基础医学院医学信息学系;3.北京大学第三医院心内科)

越来越多的证据表明,microRNA(miRNA)在很多重要的生命过程中(如细胞生长、组织分化、细胞增殖、胚胎发育以及细胞凋亡等)起着关键作用。急性心肌梗死是严重威胁人类健康的疾病,及时诊断和治疗对患者的生活质量有重要影响。本研究采用 microarray筛选与急性心肌梗死相关的 miRNA,用生物信息学方法分析了 miRNA的转录因子和靶基因的功能,探讨其与急性心肌梗死发生发展的关系,以其为阐明早期发现心肌梗死的生物标记物提供新的依据和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 大鼠急性心肌梗死模型的制备 雄性清洁级SD大鼠(180 g),复合麻醉剂行腹腔注射麻醉,固定于手术台上,四肢皮下连接心电图电极,记录标准导联心电图,胸骨上窝上正中切开皮肤,向下钝性分离推开下颌下腺,使气管充分显露,于第 2～3气管环间行气管横行切开,插入气管插管(用套管针自制),连接动物呼吸机进行人工控制呼吸。顺肋间隙方向于胸骨左旁第 3～4肋间切开皮肤,逐层分离皮下组织、肌肉,于 3～4肋骨间撑开进胸,暴露心脏,在左心耳下缘与肺动脉圆锥间可以看见左冠脉前降支起始部,用 6～0线缝针穿过左冠状动脉前降支,连同一小束心肌一起结扎,结扎后左室壁变苍白,并出现室壁运动减弱。心电监护可见Ⅱ导联 ST段明显抬高,证实模型制作成功。观察 10 min后彻底止血,逐层关胸。恢复大鼠自主呼吸,拨出气管内插管,缝合气管切口和颈部切口。假手术组除缝线不结扎外,其他制作程序与心肌梗死模型组完全相同。

1.2 RNA提取和芯片检测

1.2.1 总 RNA抽提 采用液氮研磨法将 100 mg缺血区心肌组织磨成粉末,加入 1ml Trizol混合,按trizol说明抽提总 RNA。

1.2.2 miRNA芯片检测 应用北京博奥公司 microarraymammalian V3.0芯片检测(包括 924条探针,针对人、大鼠、小鼠的成熟 miRNA,及预测的miRNA)。为保证结果的重复性和可靠性,每个实验组用三张芯片进行试验,每张芯片重复 l次.用Significance Analysis of Microarrays(SAM,version 3.0)软件挑选差异表达基因。用 Cluster 3.0对差异表达 miRNA进行聚类分析。

1.2.3 应用 qRT-PCR验证差异表达的 miRNA 应用 stem-loop RT引物进行RT反应。PCR扩增条件:95℃,15 s,60℃,30 s,40个循环;75℃至 95℃绘制溶解曲线,非变性琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增情况。

1.3 m iRNA的靶基因/转录因子预测和功能分析

1.3.1 miRNA靶基因的预测 目前预测 miRNA靶基因的常用数据库有:① miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/);②TargetScan(http://targets-can.org/index.htm l/);③PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/new PicTar-vertebrate.cgi);④miRanda(http://m icrorna.org/microrna/home.do)。由于 miRNA与靶 mRNA的互补性不高,在进行预测时仅仅依赖 6～8个碱基之间的互补。因此,预测结果可能会有一定的假阳性。为了克服这一不足,我们同时利用上述 4个数据库对同一 miRNA的靶基因进行交叉预测,这样既提高了预测的准确性,也缩减了靶基因的数量,节省了实验验证的工作量。

1.3.2 miRNA相关转录因子的筛选 miRNA是一种在转录后水平调节基因表达的小分子 RNA,其可与转录因子(TF)组成配偶体,对共同作用的靶基因进行调节,构成基因表达调控网络。在 m iRNA-TF共同对靶基因调节作用的过程中,TF可以调节miRNA,反过来也可受到 miRNA的调节,形成多样性的前馈环路(FFL s)。

我们通过 TransmiR[1]数据库(TransmiR,http://cmbi.bjmu.edu.cn/transmir),筛选了与差异表达的 miRNA相关的转录因子。

1.3.3 功能富集分析 我们应用 EASE[2]对筛选的转录因子,miRNA的靶基因,m iRNA的宿主基因进行了基因功能富集分析,并利用超几何分布假设检验分析了各 miRNA相关 TF的富集度,还对获得的 P值进行了 Bonferroni多重比较校正。

2 结果

2.1 miRNA芯片检测结果 与正常心肌组织比较,共筛选出 17个与急性心肌梗死相关的差异表达的 miRNA(上调 ＞2倍或下调 ＜0.5倍)。其中表达上调的 miRNA为 9个,分别是 m ir-31,miR-214,miR-923,miR-711,m iR-199a-3p,miR-199a-5p,mir-18a,m iR-18b。表达下调的 miRNA为 8个,分别是miR-1,miR-126,miR-29b,miR-26b,miR-451,miR-181c,miR-181d,miR-499-5p。

2.2 实时定量 RT-PCR检测 随机选取 4个 miRNA(miR-31,miR-214,miR-126,miR-499-5p)进行实时定量 RT-PCR验证.扩增曲线,融解曲线及 PCR产物电泳显示该方法具有良好的扩增效率及特异性。

2.3 实时定量 RT-PCR与 miRNA芯片结果比较参照文献,对芯片数据及实时定量 RT-PCR数据进行归一化处理,以使两者具有可比性,即从 miRNA芯片得到缺血心肌与正常心肌中不同 miRNA的信号平均值,将缺血心肌的信号值除以健康对照组的信号值,得到比值 Rarray(缺血/正常对照)。定量RT-PCR计算公式 :Rpcr=EmiR-x△CP(对照-样本)/Eu6△CP(对照-样本),U6为内参;E表示扩增效率;CP(crossing point)表示实时荧光强度显著大于背景值时的循环数。得到两组比值 Rarray与 RTPCR,比值大于 1表示上调,比值小于 1表示下调,相对于 U6,miR-31,miR-214的表达在芯片和实时定量 RT-PCR均上调;miR-499,miR-126的表达在芯片和实时定量 RT-PCR均下调,结果表明实时定量RT-PCR与芯片结果相符。

2.4 m iRNA的靶基因、转录因子及功能分析 我们发现 17个差异表达的 miRNA中的 9个有一个或以上的靶 mRNA,共筛选了 195对 miRNA-靶基因。从 TransmiR识别了 14对试验证明的 TF-miRNA,其中,14个 TF调节了 6个 miRNA(表 1)。

表1 试验证明的TF-m iRNA

这些结果提示缺血心肌中差异表达的 miRNA趋向于通过和心血管功能相关的转录因子和靶基因配对而在心血管疾病中发生作用。

绝大多数 miRNA在基因组上的位置是位于一个编码基因的内含子(intron)里,此类 miRNA叫做内含子miRNA(intronicmiRNA)。有报道表明内含子miRNA往往和宿主基因共表达[3-4],则内含子 miRNA和其宿主基因就有比较高的概率功能相关。因此可以通过了解其宿主基因的功能以及所参与的疾病预测该 miRNA可能的功能以及可能参与的疾病。

我们分析了 17个差异表达的 miRNA的宿主基因的功能,发现其中 7个 miRNA坐落在蛋白编码基因的内含子(表 2)。宿主基因的功能富集分析没有发现富集的功能,可能是由于样本量太小的原因(仅分析 7个宿主基因)。其次,我们分析了宿主基因的功能,发现 6个 miRNA的宿主基因的功能与心血管疾病相关。microRNA的这些特性进一步说明miRNA可能成为急性心肌梗死的生物学标记物和治疗靶点。

表2 内含子m iRNA及其宿主基因的功能

3 讨论

miRNA的表达具有组织特异性和时序性。对于差异表达的 miRNA的组织特异性分析,我们发现平素在心肌组织中特异性高表达的 miR-1和 miR-499-5p在缺血心肌中表达显著下调。而非心肌组织特异性表达的 miR-31和 miR-214在心肌梗死后缺血心肌中表达上调。提示心肌组织特异性 miRNA可能成为心肌梗死的新的生物标记物。

对 miRNA的转录因子靶基因及其宿主基因的功能分析发现,缺血心肌中差异表达的 miRNA趋向于通过和心血管功能相关的转录因子和靶基因配对而在心血管疾病中发生作用。这些结果进一步提示miRNA可能成为心肌梗死的新的生物标记物和治疗靶点。

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