K6SiNiW11O39对碱性成纤维细胞生长因子诱导的血管生成的影响

赫 琰,吴 强,程铁峰

(1.河南大学药学院药剂教研室,河南 开封 475004;2.开封市第六人民医院药械科,河南 开封 475001)

K6SiNiW11O39对碱性成纤维细胞生长因子诱导的血管生成的影响

赫 琰1,2,吴 强1*,程铁峰1

(1.河南大学药学院药剂教研室,河南 开封 475004;2.开封市第六人民医院药械科,河南 开封 475001)

目的:研究K6SiNiW11O39(SiWNi)对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管生成的影响。方法:应用血管内皮细胞增殖、浸润、迁移、管形成以及鸡胚尿囊膜血管形成等体内外生物学实验观察SiWNi对bFGF诱导的血管生成的影响。结果:SiWNi能够剂量相关性的抑制bFGF诱导的ECV-304细胞增殖;在SiWNi与bFGF(100 μ g/L)摩尔比为1∶1的观察点,SiWNi能够明显抑制 bFGF诱导的 ECV-304细胞的浸润、迁移、管形成以及鸡胚尿囊膜血管形成。结论:SiWNi对bFGF诱导的血管生成有明显抑制作用。

血管生成;K6SiNiW11O39;碱性成纤维细胞生长因子;细胞增殖;浸润和迁移

血管生成(angiogenesis)是指原有血管在一些血管生成因子的作用下,通过业已存在的血管的基底膜及周围基质的溶解,血管内皮细胞增殖、迁移、浸润和重排,形成新的血管并与原来血管系统吻和的过程。近年来,大量研究结果表明血管生成能够促进肿瘤细胞的发生、发展和迁移[1]。因此,抗血管生成治疗成为癌症生物治疗中的一种理想策略。目前,已有许多肿瘤诱导的促血管生成因子被鉴定出来,如血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)[1-2],它们对血管生成产生的各个步骤具有广泛的影响,已成为重要的抗癌靶点,阻断其信号转导路径已经成为抗癌药物研究的一个重要方向。文献[3]报道,聚金属氧酸盐类化合物具有广泛的抗病毒及抗癌活性。本实验以K6SiNiW11-O39(SiWNi)为代表性化合物,观察这类化合物对bFGF诱导的血管生成作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人脐静脉血管内皮细胞(ECV-304)购自武汉细胞所(TACC);Clean级受精种鸡蛋购自长春市养鸡场;K6SiNiW11O39由本实验室合成;bFGF由暨南大学生物工程研究所惠赠;MT T、小牛血清及RPMI-1640培养基为Gibco公司产品;基质胶(matrigel)、Collagen type I和8 μ m微孔的24孔细胞培养碟购自BD公司(Bedford Massachusetts);其余试剂均为市售分析纯级产品;GENIOSA-5082酶标仪为T ECAN公司产品;倒置显微镜为Olympus公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 MT T法测定SiWNi对于bFGF诱导的细胞增殖作用的影响 ECV-304细胞用含体积分数10%小牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、体积分数为5%CO2及饱和湿度的条件下培养,将对数生长期的细胞以1×103/孔的密度接种于96孔板,各孔加入10 ng bFGF以及不同浓度的SiWNi。孵育72 h后,加入MT T溶液(20 μ L/孔),37℃、体积分数为5%CO2条件下培养5 h,然后加入DMSO中止反应,在酶标仪上测定各孔溶液在570nm处的吸光度值。

1.2.2 SiWNi对于bFGF体外诱导血管内皮细胞浸润和迁移作用的影响 ①倒置细胞培养碟,在其外底侧均匀涂布 10 μ L Collagen type I,在正压净化工作台内风机中速运转的情况下,风干30min;将细胞培养碟正放在24孔培养板的空孔内,在其底侧均匀涂布10 μ L matrigel胶,风干 30min。 ②胰酶分散ECV-304细胞并用完全培养基制成1×105/mL的细胞悬液。③24孔培养板每孔中加入600 μ L完全培养基,并添加相应空白对照组(PBS)、阳性对照组(bFGF 100 ng/孔)和样品组(SiWNi∶bFGF=1∶1,molar ratio),正向放置步骤:①处理好的细胞培养碟在培养碟内添加步骤。②制备的细胞悬液100 μ L,摇匀细胞,在37℃、体积分数为5%CO2条件下培养16 h。④从细胞培养板中取出细胞培养碟,用耳科医用棉棒拭去培养碟内未浸润细胞,甲醇固定浸润细胞培养碟底膜并贴壁的细胞,Giemsa(曙红/苏木精)染色,在×200放大倍数条件下照相,并进行细胞计数,比较不同处理组之间浸润细胞数。

1.2.3 SiWNi对于bFGF体外诱导血管形成的影响 ①24孔培养板每孔中加入600 μ L matrigel胶,在37℃、体积分数为5%CO2条件下孵育30min使胶凝固。②胰酶分散ECV-304细胞并用完全培养基制成1×105/mL的细胞悬液,添加相应空白对照组(PBS)、阳性对照组(bFGF 100ng/well)和样品组(SiWNi∶bFGF=1∶1,molar ratio)。③在步骤①处理好的孔中加入步骤②制备的细胞悬液200 μ L,摇匀后放回37℃、体积分数为5%CO2条件下培养24 h。在×200放大倍数条件下照相,观察不同处理组之间内皮细胞管状排列情况、单位面积内管状结构数量以及完整程度的差异,得出定性和半定量分析结果。

1.2.4 SiWNi对于bFGF体内诱导鸡胚尿囊膜血管形成的影响 ①准备5 d龄鸡胚,从气室处开一小孔,用无菌注射器从每个鸡胚抽出约2mL蛋清,以使鸡胚绒毛尿囊膜和壳膜较好分离。②24 h内在气室处开窗,轻轻用消毒镊子剥去壳膜,暴露鸡胚绒毛尿囊膜。③取1 cm×1 cm无菌滤纸条,上面滴加10 μ L不同溶液,分别为空白对照组(PBS)、阳性对照组(bFGF 100 ng/egg)和样品组(SiWNi∶bFGF=1∶1,molar ratio),将以上滤纸条放置在尿囊膜上,然后用封口膜封口。每个处理设10个鸡胚的重复。④72 h后,观察覆盖处及周围鸡胚绒毛尿囊膜血管生成情况。最后用Nikon4500照相机在照蛋器上拍摄鸡胚尿囊膜血管形成状况。

1.3 统计学处理

实验数据用q检验,P＜0.05。

2 结果

2.1 SiWNi对bFGF诱导的血管内皮细胞增殖作用的影响

图1 SiWNi对bFGF诱导的 ECV-304细胞增殖作用的影响

由图1可知,初始单独加bFGF的ECV-304细胞悬液的光密度值为1.125±0.25,在SiWNi与bF-GF的摩尔比为0.2～1∶1的低浓度范围内,随着Si-WNi浓度的提高,细胞悬液的光密度值逐渐降低,表明SiWNi能够剂量相关性抑制bFGF诱导的血管内皮细胞增殖。

2.2 SiWNi对bFGF体外诱导血管内皮细胞浸润和迁移作用的影响

图2 SiWNi对bFGF体作用的影响(×200)

由图2可知,bFGF(100 μ g/L)阳性组细胞迁移数明显多于空白对照组以及SiWNi与bFGF的摩尔比为1的样品组。统计结果表明,空白对照组、阳性组和样品组的细胞迁移数分别为65±11、240±35和25±7。分析细胞迁移数结果可知,bFGF能够明显促进内皮细胞的迁移,而SiWNi的加入,导致内皮细胞迁移数明显降低,表明SiWNi能够明显抑制bFGF诱导的内皮细胞浸润,迁移。

2.3 SiWNi对体外bFGF诱导血管形成的影响

图3 SiWNi对体外bFGF诱导的ECV-304细胞管形成的影响(×200)

由图3可知,bFGF(100 μ g/L)阳性组内皮细胞所形成管状结构密度明显大于空白对照组以及SiWNi与bFGF的摩尔比为1的样品组。空白对照组的内皮细胞所形成的管状结构管腔大,管状结构密度低。样品组的内皮细胞所形成的管状结构与空白对照组的结构特点类似,但是在观察的视野内管状结构密度更低,管状结构出现大量间断,表明未形成完整管状结构。统计结果表明,空白对照组、阳性组和样品组的内皮细胞所形成管状结构的周长分别为(10225 ±1100)μ m 、(26968±1681)μ m 和(6649±924)μ m。阳性组管状结构的周长明显大于空白对照组和样品组,表明bFGF能够明显促进内皮细胞的管形成,而SiWNi的加入,导致内皮细胞管形成的数量和密度明显降低,表明SiWNi能够明显抑制bFGF诱导的内皮细胞管形成。

2.4 SiWNi对体内bFGF诱导鸡胚尿囊膜血管形成的影响

由图4可知,空白对照组和bFGF阳性组(100 ng/egg)的鸡胚尿囊膜血管呈叶脉状分布,清晰可见,血管分支适中,但bFGF阳性组鸡胚尿囊膜主血管和毛细血管数明显多于空白对照组,并且bFGF阳性组鸡胚尿囊膜主血管管径比空白对照组粗,表明接种bFGF明显刺激了鸡胚尿囊膜的血管生成。与这2组结果相比,SiWNi与bFGF的摩尔比为1的样品组的鸡胚尿囊膜主血管和毛细血管数明显少于bFGF阳性组,表明SiWNi明显抑制了bFGF诱导的鸡胚尿囊膜血管生成。

3 讨论

bFGF是一类与肿瘤血管生成相关的重要调控因子。bFGF能够诱导内皮细胞增殖、迁移;如果将内皮细胞在细胞外基质环境下培养,即用基质胶模拟的基底膜上培养,bFGF能够促进内皮细胞形成管状结构;此外,bFGF能够促进鸡胚尿囊膜血管形成,这些实验已普遍用于体外、体内的血管生成模拟[4]。本实验应用这些手段观察了聚金属氧酸盐类化合物Si-WNi对bFGF诱导的血管生成的影响。在体内生物学实验中:SiWNi能够剂量相关性的抑制bFGF诱导的内皮细胞 ECV-304增殖;在SiWNi与 bFGF(100 μ g/L)摩尔比为1∶1的观察点,SiWNi能够明显抑制bFGF诱导的ECV-304细胞的浸润和迁移、管形成。体外进行的鸡胚尿囊膜血管形成实验进一步证实了上述结果。因此,本实验结果表明,SiWNi具有明显的抗bFGF诱导的血管生成作用。

SiWNi是无机刚性多阴离子,其结构明显与已知的有机多阴离子bFGF抑制剂如肝素类衍生物不同。这些化合物与bFGF的作用机理主要是与bFGF通过静电作用、疏水作用等非共价键进行结合,阻断bFGF与其细胞表面受体结合,切断bFGF转导路径,从而影响其生物活性的发挥[5]。在本项研究中,我们仅考察了聚金属氧酸盐类化合物SiWNi对bFGF生物活性的影响。研究表明,SiWNi具有明显的抗bFGF诱导的血管生成作用。但是,这类化合物与bFGF作用的详尽机理有待于进一步研究。

[1]Holash J,Maisonpierre PC,Compton D,et al.Vessel cooption,regression,and growth in tumors mediatedby angiopoietins and VEGF[J].Science,1999,284(5422):1994-1998.

[2]Schmidt NO,Westphal M,Hagel C,et al.Levels of vascular endothelial growth factor,hepatocyte factor/scatter factor and basic fibroblast growth factor in human gliomas and their relation to angiogenesis[J].Int J Cancer,1999,84(1):10-18.

[3]Rhule JT,Hill CL,Judd DA,et al.Polyoxometalates in Medicine[J].Chem Rev,1998,98(1):327-357.

[4]李锦军,葛超,朱洪新,等.高通量肿瘤血管新生研究平台的建立[J].肿瘤,2001,21(6):435-440.

[5]Liekens S,Leali D,Neyts J,et al.Modulation of fibroblast growth factor-2 receptor binding,signaling,and mitogenic activity by heparin-mimicking polysulfonated compounds[J].M ol Pharmacol,1999,56(1):204-213.

[责任编辑 姬 荷]

Effects of K6SiNiW11O39on thebasic fibroblast growth factor induced angiogenesis

HE Yan1,2,WU Qiang1*,CHENG Tie-feng1(1.Medicament Department of Pharmaceutical College,Henan University,Kaifeng,Henan 475004,China;2.Medicine Subject Dept.of Kaifeng Sixth People＇s Hospital,K ai feng,Henan 475001,China.)

Objective:To study the effects of K6SiNiW11O39(SiWNi)on the basic fibroblast growth factor(bFGF)induced angiogenesis.Methods:The effects of SiWNi on the bFGF-induced angiogenesis were observed by biological assays in vitro/vivo,including proliferation,migration,invasion and tube formation of human umbilical vein endothelial cells,as well as tube formation of chicken chorioallantoic memberane.Results:SiWNi could inhibit bFGF-induced proliferation of ECV-304 cells in a dose-dependent manner;At 1∶1molar ratio of SiWNi and bFGF(100 ng/mL),SiWNi could inhibit bFGF-induced invasion,migration and tube formation of of ECV-304 cells in vitro and tube formation of chicken chorioallantoic memberane in vivo significantly.Conclusion:SiWNi could inhibit bFGF-induced angiogenesis significantly.

Angiogenesis;K6SiNiW11O39;Basic fibroblast growth factor;Cell proliferation;Invasion and migration

R966

A

1672-7606(2010)02-0116-04

2010-02-15

河南省科技攻关项目(424420041)

赫琰(1969-),男,河南通许人,硕士研究生,从事抗癌药物作用机理方面的研究工作。

*通讯作者:吴强(1970-),男,河南 开封 人,博士,讲师,从事药物与生物大分子相互作用教学及研究工作。