组织因子途径抑制物2与肝脏疾病研究进展

姜 燕，周 静 综述，姜 政审校

（重庆医科大学附属第一医院消化内科 400016）

据统计我国HBsAg阳性者约为1.2亿，其中慢性乙型肝炎患者约为3 000万，慢性乙型肝炎演变为肝硬化约300万，在此基础上合并原发性肝癌30多万，全世界每年约有100万人死于肝癌，而我国约占其中的1/3还多。组织因子途径抑制物2（tissue factor pathway inhibitor－2，TFPI－2）是一种新近发现的丝氨酸蛋白酶抑制物，可抑制包括纤溶酶、胰蛋白和基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinases，MMPs）在内的多种蛋白酶。越来越多的研究表明，TFPI－2可通过降解MMPs，抑制MMPs的活性，促进肝脏细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）过度沉积，导致合成的ECM不仅有量的变化，而且有质的改变，一方面可抑制肿瘤转移、降低肿瘤的侵袭转移能力，与此同时这种ECM质和量的改变加速激活静息状态的肝星形细胞（hepatic stellate cell，HSC），而 HSC持续激活，又大量合成ECM，进一步加重ECM的沉积，从而形成恶性循环，导致肝纤维化和肝硬化的发生。因此本文就TFPI－2结构、功能与肝脏疾病的关系作一综述，为肝脏疾病的生物学治疗奠定基础。

1 TFPI－2结构与分布

TFPI－2是1997年由Jandial和Horne首次在双胞胎妊娠者体内发现的一种蛋白，并将其命名为胎盘蛋白－5（placental protien，PP－5）。后来研究发现，PP－5和人的TFPI的氨基酸序列有很高的同源性，且两者的性质也有一定的相似性，因此最终命名为TFPI－2。TFPI－2基因位于人类染色体7q22，全长约7.0kb，含有5个外显子和4个内含子，可编码mRNA含有3个外显子和4个内含子，其翻译213个氨基酸残基，为广谱的丝氨酸蛋白酶抑制物，相对分子质量为32 000［1］。成熟的TFPI－2由5个部分组成，即富含酸性氨基酸的N端、3个首尾相连的Kunitz结构域（kunitz domain）和富含碱性氨基酸的C端，每个结构域都有3对二硫键。其中第1个结构域（KD1）表现出与TFPI－1 45%同源性以及与碱性胰蛋白酶抑制剂40%同源性，第3个结构域（KD3）与TFPI－1的相似性为53%，而第2个结构域（KD2）为35%。成熟的蛋白70%～72%为Asp－Ala－Ala－Glu－Glu－Pro－Thr－Gly－Asn－Asn结 构，约 30% 为 Ala－Glu－Glu－Pro－Thr－Gly－Asn－Asn结 构。TFPI－2 是 通 过 Kunitz结构域对蛋白水解酶进行抑制，主要是通过KD1和P1残基与蛋白水解酶的蛋白袋结构（主要是精氨酸和赖氨酸残端）的结合来抑制其活性。TFPI－2/KD1的三维结构是典型的Kunitz蛋白酶抑制剂折叠结构，即从Arg20到Phe33的双带反平行β－sheet以及从Trp48到Ala54的α－螺旋，其核心区域由3对二硫键和一定的二级结构组成，并呈高度的保守性。另外从Leu19到Tyr33的结合环与纤维蛋白酶的活性位点有直接关联，特别是与纤维蛋白酶活性位点的残基（P′1、P′2、P1和P3）都存在氢键，其中最重要的是P1残基（Arg15）［2］。与 TFPI－2/胰岛素复合物相比，TFPI－2/纤维蛋白酶复合物在接触面上多出2个氢键，这使得两者更加牢固。有研究发现，与ECM相关的丝氨酸蛋白酶抑制物是相对分子质量为33 000、27 000和31 000的蛋白，均是TFPI－2基因表达的不同糖基化产物，说明TFPI－2是一种广谱丝氨酸蛋白酶抑制物［3］。

TFPI－2广泛分布于人类肝脏、胰腺、肾脏和胎盘组织等，由表皮细胞、内皮细胞和间质细胞，尤其是肝窦内皮细胞分泌产生［4］，以 TFPI－2和其糖基化的2种亚型形式存在［5］。在正常细胞中表达的 TFPI－2能够抑制纤溶酶、MMP－1、MMP－2、MMP－3和MMP－9以及胰蛋白酶等，其在循环血液中含量极低，男性为0.190～0.750μg/L，女性为0.200～0.905μg/L，且水平不随月经周期改变，而妊娠妇女TFPI－2水平可高达40～70倍。在血浆中大多数以脂蛋白结合形式存在，在组织中主要存在于细胞外基质，约占体内含量的75%～95%。有研究发现，TFPI－2与ECM中的肝素及硫酸皮肤素的结合对TFPI－2的定位起重要作用。

2 TFPI－2的生物学功能与调控

2.1TFPI－2的生物学功能

2.1.1凝血功能 大量研究表明，TFPI是组织因子（tissue factor，TF）诱导凝血过程的负性调节物之一，可直接抑制凝血因子Ⅹа，并与凝血因子Ⅹа结合反馈抑制凝血因子Ⅶа/组织因子复合物。在正常情况下，TF与凝血因子Ⅶ（或FⅦа）结合是血液凝固的触发点，两者形成复合物后能使凝血因子Ⅶ更迅速地被血液中痕量FⅩа激活，同时也使FⅦа的活性增强1 000倍。凝血因子Ⅶа/TF复合物将更多的FⅩ活化为FⅩа，而TFPI的KD2与FⅩа活性位点结合直接抑制FⅩа的活性，当血液中TFPI达到一定浓度时，还能识别位于凝血酶原复合物中的FⅩа，从而抑制凝血酶原酶，阻碍凝血酶原激活，减少凝血酶的生成，防止血栓的形成，正是这种TF与TFPI动态平衡的维持，防止了血液系统的疾病［6］。

2.1.2维持ECM 及基底膜（basement membrane，BM）的完整性 在正常情况下，TFPI－2能与 MMPs、ECM及BM结合，阻止MMPs与ECM结合，且进一步成为MMPs的粘合剂并降解MMPs，从而阻止MMPs对ECM和BM的破坏，保持ECM和BM的完整性，有利于阻止疾病的侵袭与扩散。同时TFPI－2可以增强金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloprotienase，TIMP）与 MMPs结合部位的结合和提高其降解MMPs的能力［7］。

2.1.3抑制肿瘤细胞的侵袭与转移 恶性肿瘤引起患者死亡的一个重要原因是肿瘤的侵袭和远处转移，而恶性肿瘤的转移是多因素和多阶段实施的复杂过程，涉及肿瘤细胞自身生长优势的获得、细胞间黏附能力的降低、肿瘤细胞对ECM和BM的降解和破坏、细胞骨架重构引起的细胞运动和迁移、细胞因子诱导肿瘤细胞特异定向归巢以及肿瘤血管、淋巴管生成，细胞凋亡和免疫杀伤等诸多因素，由于ECM的特殊结构和组成成分，不仅是肿瘤侵袭、转移的天然组织屏障，而且是肿瘤细胞与周围环境相互作用的场所，因此ECM在肿瘤发生、发展的整个过程中都起着重要的作用，而MMPs作为ECM微环境的重要组成成分，不仅通过降解ECM促进肿瘤的转移，而且通过酶解从细胞表面和ECM释放的生物活性丝裂因子（FGF、IGFs和EGF），促进肿瘤侵袭和转移。一方面丝裂因子调控肿瘤细胞的生长、增殖、新生血管的生成等，另一方面上调MMPs的表达与分泌，又进一步促进丝裂因子的释放。因此降解MMPs，同时抑制MMPs的活性与功能可阻止和控制肿瘤的侵袭与远处转移。

据研究，TFPI－2作为一种广谱的丝氨酸蛋白酶抑制剂，能明显抑制肿瘤中的MMPs活性和功能从而抑制肿瘤的侵袭、转移能力，其抑制肿瘤的侵袭、转移的可能机制如下：（1）抑制肿瘤新生血管的形成［8］。其主要机制包括下调血管内皮生长因子－C（VEGF－C）、VEGF－R1和IL－8的表达。在对神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和恶性脑膜瘤等研究中发现，TFPI－2通过抑制新生血管的形成抑制肿瘤细胞的生长，降低其与对周围组织的侵袭及远处转移的能力；其次通过抑制纤溶物和金属蛋白酶、增强其抑制物的活性等加速ECM的沉积以及重塑［7］。据研究，VEGF以时间、剂量依赖性增加内皮细胞TFPI－2的转录和表达，同时对 TNF－α、IL－1β和 FGF－2的刺激可明显上调TFPI－2mRNA，相反 TFPI－2能明显抑制由 VEGF和 FGF－2介导的内皮细胞增殖，从而减少新生血管的形成［9］。（2）诱导肿瘤细胞凋亡。近年来研究发现，TFPI－2在抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡中发挥重要作用，VEGF能够上调TFPI－2的表达，进而降解丝氨酸的蛋白产物以结合细胞凋亡受体，引导细胞程序性死亡。现已证实，凋亡蛋白（Bax）表达的增加和（或）抗凋亡蛋白Bcl－2表达的抑制均可导致线粒体膜渗透性的改变甚至破裂，继而引起线粒体细胞色素C的释放，而细胞色素C可进一步激活caspase－3并诱发凋亡的发生。TFPI－2可使Bax的表达水平增高，而X连锁凋亡抑制蛋白、Bcl－2的表达水平降低，同时增强caspase－9、caspase－3、TNF－α、Bax、Fas相关的死亡结构域、TNFR－1有关的死亡结构域和Fas配体的活性，从而导致肿瘤细胞凋亡增加，发挥其抗肿瘤的效应［10－12］。（3）抑制MMPs。ECM由多种蛋白聚糖组成，在细胞黏附、迁移、生长和分化中起重要作用，其内环境的稳定依赖生长因子、蛋白水解酶及其抑制剂之间的动态平衡。各种肿瘤细胞分泌的蛋白水解酶，如MMPs所参与的ECM的降解是肿瘤发生侵袭和转移的关键步骤。由于TFPI－2与金属蛋白酶组织抑制剂有相似的结构，其氨基末端自由氨基上存在Zn2＋活化位点，可以通过多价螯合剂作用与MMPs及MMP前体结合，从而抑制各种丝氨酸蛋白酶及 MMPs，如 MMP－1、MMP－2、MMP－9和MMP－13等与ECM结合，降低对ECM的破坏作用，因此TFPI－2能够抑制ECM的降解，在肿瘤的侵袭和转移中发挥调节作用［13］。（4）抑制 TF/FⅦа复合物［8］。肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞表面常有TF的异常表达，与FⅦа形成TF/FⅦа复合物是外源性凝血途径的始动因子，与肿瘤的高凝状态有关，能够增加肿瘤的侵袭、转移特性，其效应可以被TFPI－2所抑制，而TFPI－2作为组织因子途径的重要生理抑制物则可能在抑制TF/FⅦа复合物介导的信号传导途径中发挥作用，抑制肿瘤的侵袭与转移［6］。

2.2TFPI－2基因表达的调控 TFPI－2基因位于人类染色体7q22，全长约7.0kb，含有5个外显子和4个内含子，所有的外显子和内含子周围的核苷酸序列都比较保守，服从GT－AC原则，TFPI－2mRNA启动子有典型的管家基因特征，在TFPI－2基因调节中起关键作用：（1）凝血酶上调TFPI－2基因的表达。该效应发挥依赖于G蛋白偶联受体Ⅰ及环氧合酶－2，以通过促分裂原活化蛋白酶依赖途径增加环氧合酶－2mRNA的表达，进而促进促分裂原活化蛋白酶/环氧合酶－2依赖的信号传导途径上调TFPI－2。凝血酶介导的TFPI－2上调表达能抑制MMP前体的活化，降低MMP对ECM的降解。（2）炎症介质以及理化因素可调节 TFPI－2基因的表达。IL－1、TNF－α和INF－α、β、γ等炎症介质、内毒素以及山梨醇和紫外线等理化因素通过增加cAMP激活蛋白激酶C途径或通过激活蛋白激酶/c－Jun氨基酸激酶信号传导途径实现对TFPI－2基因表达的调节，TFPI－2启动子区域的4个AP－1结合位点在该过程中起重要作用。（3）TFPI－2的凝酸胞苷酰（cytidylyl phosphate guanosine，CPG）可调节 TFPI－2基因的表达。TFPI－2基因存在1个典型的220bp的CPG岛区域，跨越外显子1和3个转录起始位点，其中G＋C含量大约77%，TFPI－2基因的沉默与CPG岛甲基化有关，与KLF－6结合的启动子DNA超甲基化可阻止TFPI－2的转录与表达［12］。多种肿瘤中TFPI－2的表达受到抑制都与CPG岛甲基化有关，同时TFPI－2甲基化常常提示组织细胞的恶性演变［13－14］；同时发现 TFPI－2mRNA 的表达与TFPI－2甲基化呈负相关［20］；而5′乙酰唑胺和曲古抑菌素A能解除CPG岛甲基化，两者结合可发挥协同效应，增加TFPI－2的表达，抑制肿瘤的侵袭和转移［15］。除此之外，细胞外信号调节激酶/促分裂原活化蛋白酶信号传导途径也参与对TFPI－2基因表达的调节［16］。

3 TFPI－2与肝脏疾病

3.1TFPI－2与肝硬化 目前认为肝纤维化是肝损害持续存在，组织发生修复反应时因ECM合成、降解与沉积不平衡而引起的病理过程，而TFPI－2过度表达在肝纤维化和肝硬化的发生与发展中起到了推波助澜的作用。据研究，TFPI－2具有降解MMPs、抑制MMPs的活性、同时与TIMP一起共同促进ECM过度沉积的作用。合成和沉积的ECM不仅有量的变化，而且有质的改变，这种ECM质和量的改变又加速激活静息状态的HSC，而HSC持续激活后又将导致：（1）HSC数量增多，合成ECM能力增强，从而导致胶原合成增加［17］；（2）纤维凝聚加强和胶原降解减少，这主要缘于HSC MMPs及TIMP表达的改变，随着纤维化的进展MMPs下降，伴随TIMP的表达上调，TIMP/MMPs比值增加，导致胶原降解减少［18］；（3）ECM比例失调以及ECM质和量的改变，导致HSC分泌不溶性Ⅰ型胶原明显增加，取代Ⅲ型胶原而成为肝内主要胶原，进一步引起ECM分子结构发生微异质性改变，形成恶性循环。因此TFPI－2过度表达在肝纤维化和肝硬化的发生与发展过程中起到了重要的病理生理作用。以TFPI－2作为靶点治疗肝纤维化将成为肝纤维化基因治疗的一个途径。如果采用现代分子生物学技术阻断TFPI－2的过度表达，从而切断其降解MMPs、抑制MMPs活性的作用，加速ECM的降解，从而在一定程度上达到预防和治疗肝纤维化的目的［19］。

3.2TFPI－2与肝癌 由于ECM是肿瘤侵袭、转移的天然组织屏障，同时是肿瘤细胞与周围环境相互作用的场所，因此ECM在阻止肿瘤侵袭与转移的过程中起着重要的作用。由于肿瘤细胞大量分泌MMPs，不仅降解ECM促进肿瘤的转移，而且通过酶解从细胞表面和ECM释放的生物活性丝裂因子（FGF、IGFs和EGF），促进肿瘤细胞的生长、增殖以及新生血管的生成等，同时丝裂因子上调MMPs的表达与分泌，又进一步促进丝裂因子的释放，形成恶性循环。因此降解MMPs、抑制MMPs的活性可阻止和控制肿瘤的侵袭与远处转移。据研究，导致肿瘤的侵袭与转移常常是TFPI－2基因在肿瘤细胞中的突变、甲基化以及 TFPI－2不表达所致［20－21］。Rao等［22］分别测定了人类高度恶性、中度恶性以及低度恶性的神经胶质瘤中TFPI－2的表达，发现TFPI－2mRNA和蛋白质表达水平与肿瘤恶性程度呈负相关，而恶性程度最高的肿瘤细胞株体内转移、侵袭能力最强，其TFPI－2几乎无表达，同时将TFPI－2基因转染到高度恶性的肿瘤细胞中，则发现明显抑制肿瘤的侵袭与转移能力。Jin等［23］将TFPI－2转染到绒毛癌细胞株JAR研究TFPI－2与绒毛癌细胞转移、侵袭能力的关系发现，恶性肿瘤不表达TFPI－2，其转移、侵袭能力较强，而经转染后表达TFPI－2，其侵袭力减弱，说明TFPI－2表达的下调与肿瘤侵袭、转移能力呈正相关。据 Wong等［24］研究发现，在大约90%原发性肝癌中TFPI－2低表达或不表达，47%肝癌以及80%肝癌细胞系存在TFPI－2启动子甲基化，从而导致TFPI－2转录和表达减少，而脱甲基作用的5′乙酰唑胺和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂——曲古抑菌素A使TFPI－2去甲基化后能恢复TFPI－2的表达；同时发现异位过表达的TFPI－2能明显抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，提示TFPI－2是一种候选的抑癌基因［25］。因此采用现代分子生物学技术增加TFPI－2的表达，增强TFPI－2活性，有助于降解MMPs等多种蛋白水解酶，从而达到预防和治疗肝癌的目的。

4 问题与展望

尽管20世纪在肝纤维化和肝癌研究领域已取得重大突破，然而目前可用于肝纤维化和肝癌基因治疗的靶基因还相当有限，更多基因的功能还需要进一步认识和挖掘，而TFPI－2是一个组织因子途径抑制物，在肝纤维化和肝癌的发生与发展中具有不同的病理、生理作用，同时在基础与临床应用研究过程中仍有许多问题亟待解决，如TFPI－2对各细胞因子和相应的传导途径的影响如何？在肝纤维化和肝癌形成过程中的作用孰轻孰重？同时针对肝纤维化和肝癌复杂的分子机制，如何进行多靶点协同调控以提高疗效以及如何实现基因治疗中的靶向性、调控性以及安全性？因此肝纤维化与肝癌的基因治疗目前依然任重道远。针对目前存在的问题，下一步研究重点将是TFPI－2在体内、外的表达调控和对细胞转移机制作用探讨以及在动物模型中进一步研究TFPI－2的作用，为临床的开发与利用奠定基础。

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