细胞生长因子在小动物角膜损伤修复中的作用*

丁 一,王 琼,陈建国,程莉莉,吴仪强,熊 成,周敏燕,魏 嘉

(华中农业大学动物医学院,湖北武汉 430070)

细胞生长因子在小动物角膜损伤修复中的作用*

丁 一,王 琼,陈建国*,程莉莉,吴仪强,熊 成,周敏燕,魏 嘉

(华中农业大学动物医学院,湖北武汉 430070)

小动物(尤其犬和猫)角膜损伤在兽医临床上十分常见。角膜损伤治疗不当或愈合延迟会导致视力障碍,甚至失明。研究表明,在角膜损伤的修复中细胞生长因子有成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子-β、角质细胞生长因子、血小板衍生生长因子和神经生长因子等,起着重要的调节作用。这些细胞生长因子通过自分泌或旁分泌作用于角膜组织细胞相应受体,并经多种信号转导通路影响其下游产物的表达,调控角膜细胞的增殖、迁移、分化和凋亡。细胞生长因子及其受体在角膜组织各层的分布、数量和作用的时序性差异决定着损伤角膜的有效修复。体内及体外研究显示,细胞生长因子将在小动物临床上有广阔的应用前景。

细胞生长因子;角膜损伤修复;犬;猫

近十多年来,随着我国宠物饲养数量的不断增加,兽医临床接诊犬猫的眼病中因机械性或感染性因素引起角膜损伤的病例逐渐增多。同时,眼部手术,如白内障手术、青光眼手术、角膜清创手术、角膜表层切除手术也逐渐开展起来。这些手术也伴随角膜损伤的发生。角膜损伤治疗不当或愈合延迟会导致角膜混浊、溃疡、穿孔、色素沉着或失明。

目前,角膜损伤治疗的药物十分有限,除抗病毒和抗菌药物外,临床上使用的主要为糖皮质激素类药物。但此类药物因降低角膜上皮细胞增殖率,不适宜于治疗角膜损伤[1]。因此,探索眼角膜损伤有效治疗方法是人医和兽医眼科界关注的热点。人们已对小动物(特别是实验动物)细胞生长因子及其受体在角膜各层中的分布、细胞因子作用的途径,以及它们在修复中的不同作用进行过大量深入的研究,结果显示细胞生长因子在角膜损伤愈合中具有重要作用。

1 角膜损伤与修复特点

角膜是一种无血管的透明组织,由上皮层、基质层和内皮层组成。另外,还存在两种重要的膜,即在上皮层与基质层间的Bowman膜(又叫前弹力层)和基质层与内皮层间的Descemet膜(又叫后弹力层)。角膜上皮细胞由5层～7层构成,正常情况下底层角膜上皮细胞分化、逐渐向上层迁移,取代脱落的表层角膜上皮细胞。现认为当角膜受到损伤时,损伤信号被传导至位于角膜缘的角膜干细胞,角膜干细胞增殖、分化,并向受损区迁移[2]。一旦增殖的角膜细胞完全覆盖受损区后,角膜干细胞可能通过“角膜上皮细胞的接触抑制机制”停止角膜上皮细胞的增殖活动[3]。角膜前弹力层在一定程度上可抵御机械性和病理性损伤。一旦前弹力层破坏,愈合后形成不透明的疤痕组织,影响角膜透明。角膜后弹力层也具有一定的抗损伤能力和再生能力。猫、灵长类等角膜内皮细胞增殖能力低,受损的角膜内皮层主要依赖现存角膜内皮细胞的膨大、移位而非有丝分裂的方式参与对损伤的修复[4-5]。在角膜损伤的修复过程中,细胞生长因子,如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、角质细胞生长因子、血小板衍生生长因子和神经生长因子,起着复杂的调节作用[3]。

2 细胞生长因子分布、表达及其作用

细胞生长因子是指具有促进细胞增殖分裂作用的细胞因子。一般情况下,细胞生长因子以一定含量维持角膜组织内环境稳态。当角膜组织受损后,其分泌量发生变化,从而引起对角膜层细胞增殖、分化、移行的促进或抑制作用。不同细胞生长因子的分布和作用特点是有差异的,正是这种差异使其调控作用呈复合立体式的特点。

2.1 成纤维细胞生长因子

在20世纪40年代,人们从动物脑中发现有一种促进纤维细胞增殖的物质,20世纪70年代从牛垂体中纯化出该物质,并命名为成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)。FGF有两种形式,即碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。它们在结合硫酸类肝素蛋白多糖后被激活,结合后的生长因子不被降解,使之能够结合到高亲和力细胞表面受体酪氨酸激酶上。bFGF为17 ku～20 ku的多肽,其活性比aFGF高10倍～100倍,分布于角膜上皮、基质、内皮和眼房液中,具有促进细胞增殖、移行和分化作用[6]。研究表明,bFGF在体内或体外能促进多种动物角膜上皮创伤的愈合[7]。但Foreman D M 等[8]采用体外角膜培养法研究显示bFGF对牛和人角膜上皮增殖没有明显影响。这些报道的差异可能与研究的动物种属、采用的细胞系或细胞来源、靶细胞的发育或分化状态、细胞密度、细胞因子浓度、有无其他细胞因子存在、培养方法和条件等因素不同有关。

碱性成纤维细胞生长因子在犬和猫角膜损伤愈合中的作用研究报道较少。Changmin H等[9]采用不同浓度bFGF作用于体外培养的犬角膜上皮细胞,以MT T法检测细胞增殖率,发现1 ng/mL～100 ng/mL bFGF均有促犬角膜上皮增殖作用,其中10 ng/mL bFGF效果最好。然而,体外的单层细胞培养并不能提供生理环境下的角膜成份细胞,因角膜是由多层而非单层细胞构成、角膜细胞与对其具有重要相互作用的角膜基质细胞紧密接触以及角膜上皮细胞具有的“中心迁移”作用。为了进一步证实bFGF在犬体内对角膜损伤愈合的促进作用,Hu C等[10]采用角膜圆锯创伤模型,以荧光素染色法观察角膜愈合率,对bFGF局部应用效果进行了研究,结果发现bFGF对角膜上皮创伤愈合的促进作用在100 ng/mL～1 000 ng/mL浓度范围内呈剂量依赖性。由于泪液和基质层中还存在其它细胞因子(如表皮生长因子、转化生长因子-β),bFGF在体内促角膜创愈合作用可能是其单独或与其它细胞因子共同作用的结果。

bFGF是一个多效性细胞生长因子,对多种细胞(包括血管和毛细血管内皮细胞)均具有活性作用,能诱导组织血管增殖反应[11]。新生血管形成在角膜创愈合过程中有不利影响,如角膜透明度降低、角膜色素沉着[12]。Hu C等[10]观察到bFGF作用的犬角膜创在7 d内均已愈合,没有新生血管的形成。可见在短期内应用bFGF并不会导致犬角膜血管的形成,但若长期使用可能有不利影响出现。

2.2 表皮生长因子

表皮生长因子(epidermal grow thfactor,EGF),是一种小分子多肽物质(6 045 ku),在泪腺中含量较高。研究表明,表皮生长因子受体分为高亲和性受体和低亲和性受体;除了角膜基质层只存在低亲和性受体,上皮层和内皮层都含有两种受体,上皮层以高亲和性受体为主,而内皮层则相反[13]。显然,EGF主要在角膜上皮对其生长起促进作用。角膜上皮的表皮生长因子受体(EGFR)在角膜缘基底细胞中的含量比中心基底细胞高4倍～5倍,在角膜上皮损伤后缘上皮细胞的增殖能力远高于角膜中心细胞[14]。这与角膜上皮受损后,首先是通过角膜缘干细胞增殖使受损区域周围细胞移行以覆盖受损区域这个特点一致。抑制 EGFR的活体试验显示EGFR能维持角膜厚度,而且这种作用不仅是通过泪液中EGF,而且还是通过角膜层中的EGF和TGF-α活动引起;特异的抑制EGFR只能延迟而不能阻止角膜的愈合,这是因为在角膜上皮中还有其它细胞生长因子的作用[15]。

在体内和体外模型系统中,EGF通过促进角膜上皮细胞移行和有丝分裂来促使角膜损伤愈合。在体外,EGF在浓度大于0.1 ng/mL时以剂量依赖性的方式促进角膜上皮细胞增殖[16-17]。在体内,EGF局部运用浓度在10 μ g/mL～20 μ g/mL时能改善角膜愈合速率[18],在 10 μ g/mL～ 50 μ g/mL 时能在角膜低密度区促进上皮细胞移行,并且对促进细胞外基质(extrocellular matrix,ECM)相互作用和纤连蛋白底物关联的趋触性移行也有重要作用[19]。

2.3 角质细胞生长因子

角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)为FGF家族中的一员,由一条大约28 ku的多肽链组成。它在上皮组织来源的基质层细胞中广泛表达,能特异地促使角质细胞和上皮细胞有丝分裂。KGF与肝素结合可导致肝素在间质的ECM中沉积,并且在ECM中储存和调节释放。

KGF受体mRNA在角膜上皮中含量较高,但在基质层的角质细胞中不存在或含量较低。相反,KGF的转录产物存在于被培养的基质层细胞而不是上皮细胞[13]。由此表明,这种细胞生长因子由基质层细胞产生,且以旁分泌的形式作用于上皮细胞。在体外添加10 ng/mL～100 ng/mL KGF能促使角膜上皮细胞DNA合成和细胞生长,但对细胞移行和分化没有明显作用[21]。在未受损的角膜,基质层细胞持续低量的表达KGF,维持角膜上皮功能,而且这种维持还被泪腺产生的KGF所加强[22]。应用KGF滴眼,对上皮重生以及缺失基质的角膜溃疡治疗有较好效果[13]。

2.4 转化生长因子

转化生长因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)家族包括 TGF-β1、TGF-β2和 TGF-β3,由多种组织产生的25 ku多肽,通常是以一种非活化的形式被细胞分泌出来,与ECM高亲和性结合产生隐性生长因子群。细胞外或细胞膜结合酶对该复合物进行蛋白水解,使生长因子激活。激活的TGF-β与配体TGF-β糖蛋白受体Ⅰ和Ⅱ结合,有时还会有TGF-β受体Ⅲ辅助结合。

TGF-β2前 mRNA在角膜的各种细胞中都存在,而 TGF-β1前 mRNA在3个角膜层中只有少量被检测出,TGF-β3几乎在角膜中不存在[13]。这显示TGF-β2在角膜中发挥主要作用。TGF-β受体定位在角膜基质层细胞,而角膜上皮缘和中心也有不等量的3种受体[22]。

TGF-β在体外和体内作为肌纤维母细胞的关键调控物早已为人们所知。TGF-β来源于角膜上皮和泪液。在正常无损伤的角膜,上皮的基底膜限制TGF-β进入基质。一旦损伤发生,结构和功能被破坏的基底膜使该生长因子持续渗入基质。TGF-β的功能活动依赖目的细胞类型、细胞分化状态、细胞外环境和其它细胞因子存在。它对许多细胞过程有宽范围和相反作用的特点。在体外添加1 ng/mL TGF-β可诱导 EGF高亲和力受体的表达,增强EGF对角膜上皮细胞生长的促进作用[23]。TGF-β还能较弱地抑制EGF介导的上皮细胞移行作用,较强地抑制由KGF介导的角膜上皮细胞生长作用[13]。在角膜损伤愈合的过程中,TGF-β还影响细胞外基质的产生、移行和细胞粘连。TGF-β在促进ECM产生的同时,也抑制ECM 蛋白质水解和裂解,可使细胞外基质网状聚集,促进疤痕形成[23-24]。

2.5 血小板源性生长因子

血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)是一种由A和B两种肽链组成的多肽生长因子,以同型二聚体(AA或BB)和异源二聚体(AB)两种相互联系又有区别的多肽作为功能单位。PDGF与它的酪氨酸激酶受体结合调控其效应。同样,其受体也有α和β两种形式,受体α与A和B两条链同时结合,而β受体优先结合B链。

PDGF存在于泪液和角膜上皮中,其受体在于角膜基质细胞和内皮细胞[25]。PDGF是一种促有丝分裂和趋化性的因子,调控角膜愈合功能,如基质细胞增殖和移行。与TGF-β相似,在正常情况下上皮的基底膜隔绝了其配体和受体的相互作用。上皮基底膜受损后,这些生长因子渗入基质层诱导前体细胞分化为肌纤维母细胞[25]。

在角膜损伤的动物模型中,利用一种表达PDGF受体β的带有内质网固着信号的质粒载体(pCMV.PDGFRB.3KDEL),使 PDGF 阻断,可通过α平滑肌肌动蛋白(α SMA)含量确定肌纤维母细胞的密度和评价角膜混浊程度。PDGF与 TGF-β一起,参与基质层和上皮的相互作用,调控肌纤维母细胞增殖,进而影响角膜基质层的透明。目前,还不能解释在PDGF被阻断的基质中,为什么基质浑浊的增加没有和α SMA+肌纤维母细胞密度增加相平行[26]。这可能需要我们进一步从肌纤维母细胞分化过程中去寻找线索。另外,PDGF受体α和 α-SMA的双重免疫组化表明,在受损角膜基质中PDGF受体α主要在上皮基底膜下α-SMA阳性的肌纤维母细胞中表达[27]。

2.6 神经生长因子

神经生长因子(nerve grow th factor,NGF)是神经营养因子家族中最早被分离的最具特色的一种因子。它不仅维持感觉神经元生存,而且对非神经细胞也有影响。NGF存在于泪液和角膜上皮中,对角膜上皮细胞功能的维持和角膜损伤愈合起重要作用。证据显示NGF3和NGF4、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子及其受体存在于角膜,能促进上皮细胞增殖[28]。

NGF和它的高亲和力受体存在于三个角膜层,尤其是上皮和内皮层[28]。研究表明NGF和受体在犬泪腺和第三眼睑中存在,角膜上皮受损后它们的量增加[29]。除了影响角膜上皮细胞,NGF在角膜损伤时能够诱导成纤维细胞分化为肌纤维母细胞,促进金属蛋白酶-9表达激活和胶原凝胶收缩。NGF和TGF-β一起双向控制成纤维细胞。在体内,局部应用NGF,伴随感觉神经的修复,角膜溃疡也迅速愈合[30]。

3 细胞生长因子的调控机制

细胞生长因子主要通过旁分泌(如KGF)、自分泌(如 TGF-β)、或自分泌和旁分泌两种形式(如EGF、FGF、PDGF)作用于角膜组织,调控细胞的增殖、移行、分化和凋亡。细胞因子首先作用于细胞表面相应的受体,并将调控信号传递至细胞内,引起一系列级联反应。

作用于角膜细胞的细胞生长因子多经过相似的信号转导通路影响其下游产物的表达,现以EGF为例加以说明。EGF与其相应细胞膜受体结合,导致受体的二聚化,使其胞内酪氨酸激酶域磷酸化,通过G蛋白激活磷脂酶C(phospholipase C,PLC)。活化的PLC水解磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-biphosphate,PIP2),产生两种活性的第二信使物质,即二酰基甘油(diacylglycerol,DAG)和肌醇 1,4,5-三磷酸(inositol-1,4,5-triphosphate,IP3)。IP3和DAG均可促使蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的活化。IP3还可引起细胞内贮存钙的释放,通过活化钙调蛋白依赖的蛋白激酶促使PKC的激活。活化的PKC导致丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号级联反应,最终引起细胞增殖、迁移、分化和凋亡[2]。EGF受体的酪氨酸磷酸化后的第二条信号转导通路是其与衔接蛋白Src同源域结合,导致Ras(一种G结合蛋白)活化,继而激活丝裂原激活蛋白激酶信号级联反应,其中Raf为此级联反应系统中的第一个蛋白激酶,即 MAPKKK(MAPK kinase kinase)[14]。活化的EGF受体还有另一信号转导通路,即其激活胞浆型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2),促使花生四烯酸从细胞膜磷脂中释放,以增加前列腺素 E2(prostaglandin E2,PGE2)的合成。前列腺素水平的增加,促使腺苷酸环化酶的活化,增加cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的活性。PKA对Raf起负反馈调节作用[2]。

细胞生长因子对细胞的调控作用还受ECM的影响。ECM与细胞生长因子结合导致其对细胞生长因子的隔绝或有控制的释放,以调节或增强他们的效果[26]。

4 结语

在角膜损伤的修复中bFGF、EGF和TGF-β起着主要的调节作用,KGF、PDGF和NGF也起着一定的调节作用,这些细胞因子通过旁分泌和自分泌作用于角膜细胞的相应受体,调节角膜细胞的生长、迁移、分化和凋亡。现有的研究结果显示这些细胞生长因子在小动物角膜损伤的修复中有良好的应用前景。

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Roles of Cell Growth Factors in the Repair of Corneal Wound in Small Animals

DING Yi,WANG Qiong,CHEN Jian-guo,CHENG Li-li,WU Yi-qiang,XIONG Cheng,ZHOU Min-yan,WEI Jia

(College of Veterinary Medicine,Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei,430070,China)

Corneal injuries of small animals(especially dogs and cats)are commonly seen in veterinary clinic.The inadequate treatment or delay of the corneal wound healing would result in sight barrier,even blindness.Studies show that cell grow th factors,such as fibroblast growth factor,epidermal growth factor,transferring growth factor-β,keratinocyte grow th factor,platelet-derived growth factor and nerve grow th factor,play important regulating roles in the repair of corneal wound.These autocrine or paracrine cytokines act on their responding receptors,influence on the downstream product expression,and elicit the control of growth,migration,differentiation and apoptosis of corneal cells through various signaling transduction pathways.Discrepancy in the distribution,quantity and time-acting sequence of cell growth factors and their responding receptors involves in the effective repair of corneal wounds.In vitroandin vivoexperiments indicate that cell growth factors have good perspective in small clinic practice.

cell growth factor;repair of corneal wound;dog;cat

S857.144

A

1007-5038(2010)08-0088-05

2009-12-13

丁一(1988-),男,湖北武汉人,主要从事动物分子生物学研究。*通讯作者