RNA干扰抗丙型肝炎病毒的研究进展

张国海,梁丽英综述,许瑞安,2审校

(华侨大学:1.分子药物学研究所,泉州362021;2.分子药物教育部工程研究中心,泉州362021)

RNA干扰抗丙型肝炎病毒的研究进展

张国海1,梁丽英1综述,许瑞安1,2审校

(华侨大学:1.分子药物学研究所,泉州362021;2.分子药物教育部工程研究中心,泉州362021)

丙型肝炎病毒;siRNA;microRNA;RNA干扰;联合治疗

丙型肝炎病毒(HCV)感染严重危害全人类健康,是主要的公共卫生问题之一。据估计全世界 HCV阳性率为3%,大约有1.7亿的感染者[1]。令人遗憾的是,到目前为止,市场上仍然没有安全、有效的疫苗或抗体来防止 HCV感染。目前慢性 HCV感染的标准疗法是联合使用聚乙二醇α-干扰素和利巴韦林(ribavirin)。然而,这种标准疗法的成功却取决于病毒的基因型和治疗之初病毒的载量,仅有约50%的患者会产生持续的病毒学应答,因而不能彻底根除病毒。此外,高昂的价格和严重的不良反应也限制了这种标准疗法的广泛使用。开发新型的、更加安全有效的抗病毒治疗方法具有时空紧迫性和重要现实意义。

充分了解病毒感染、复制机理,以及在此过程中与宿主细胞相关因子的相互作用是开发新型治疗方法的先决条件,不但可以认识发病全过程,而且可以从中发现新的治疗靶点和途径。近年来在探索 HCV病毒基因组学和病毒感染、复制机理方面取得了重大突破,研究表明基于siRNA和micro RNA的干扰治疗有望成为抗病毒治疗的新型治疗方法。本文就RNA干扰在抗病毒治疗中取得的最新进展作一综述。

1 基于siRNA的抗病毒分子治疗

1.1 RNA干扰的作用机制 RNA干扰 (RNAi)又称转录后基因沉默,是在m RNA水平上调节基因表达的一种特有方式,最初发现于1998年。当时,Fire和M ello等发现把反义核糖核酸和正义核糖核酸的混合物导入后,其发挥的抑制效应远远强于单独导入反义核糖核酸或正义核糖核酸的抑制效应。后来的研究表明是被切割成22～25 nt小片段干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性的降解了m RNA,导致基因沉默的效应。这种能特异性诱导基因沉默的核酸片段既可经由化学合成 siRNA直接导入细胞,也可由表达双链 RNA(dsRNA)载体间接导入。化学合成的siRNA导入细胞后能直接发挥基因沉默效应,而由载体导入的长双链RNA或者短的发卡RNA(shRNA)则需一种具有RNA酶Ⅲ活性的内切酶“Dicer”的切割下形成具有活性的siRNA。随后siRNA与核酶复合物相结合形成 RNA诱导的沉默复合体 (RISC),与此同时,进入复合物的双链siRNA也随着RISC的激活而被解成单链。其中只有一条链被参入复合体中,作为引导序列通过碱基互补的原则识别同源性的m RNA,与复合体结合的m RNA被核酸“Dicer”切割成21～25 nt的片段,从而特异性地抑制靶基因表达。siRNA还可以在 RNA依赖性 RNA聚合酶 (RdRp)的作用下大量扩增,新合成的 dsRNA再经“Dicer”酶切割,形成新的 siRNA,再作用于靶向m RNA,进而产生级联放大效应,终使靶向m RNA全部降解,达到抑制相应基因的表达的目的[2]。

1.2 病毒靶向性干扰治疗 作为一种新技术,越来越多的研究表明RNA干扰可用于 HCV抗病毒治疗。RNA干扰是通过特异性的降解同源性的m RNA,从而达到在转录后水平上调节基因表达。HCV的基因组是一条单链的RNA,它既可作为转录的模板,也可作为中间体负链复制的模板,是最佳的干扰对象[3]。尤其是位于 5′非编码区的内核糖体进入位点(IRES),序列的保守性以及在翻译过程中的重要作用[4]使其成为RNA干扰最理想的目标。Ilves等[5]将靶向于IRES的发卡RNA(shRNA)转入到培养细胞和老鼠体内,发现依赖于HCV IRES的基因表达受到明显的抑制。Kanda等[6]采用载体将靶向于IRES IIId亚基和 IIIe亚基之间部分的发卡RNA(psh-274)导入到持续感染1a型 HCV(H77)或2a型 HCV(JFH1)的 Huh-7.5细胞中,病毒的复制受到明显的抑制,且没有引起免疫反应。Meng等[7]利用细胞穿膜肽 H IV Tat蛋白转运靶向于5′非编码区颈环结构的 siRNA,在 Huh-7细胞中,能显著抑制 HCV的复制。这说明对 IRES特异靶向的RNA干扰能够有效地进行抗 HCV病毒治疗,尤其是载体介导的shRNA较之于 siRNA,能够更加长期有效地抑制 HCV复制,其安全性更高。尽管特异靶向于 IRES的RNA干扰非常有效抑制HCV病毒复制,却不能从源头上清除病毒。Gamble等[8]采用靶向于 IRES的反义DNA与人工构建的核糖核酸酶结合,发现这些药物在感染 HCV的 Huh-7细胞中,不但可抑制 HCV的复制,而且利用人工构建的核糖核酸酶通过在HCV基因组的某个位点进行切割抑制 HCV的转录,进而大大提高了抗病毒效果。

除此之外,HCV病毒核心以及非结构区域NS3、NS4B、NS5A和NS5B也常被选择为RNA干扰用于病毒靶向性分子治疗的重要靶点。特别是序列保守性最高的NS5B,常常是人们研究的热点。

HCV RNA依赖的RNA聚合酶 (NS5B)对正链、负链的合成起着决定性作用。先前就有研究证实了靶向NS5B进行抗病毒分子治疗的可行性[9]。2004年 Takigawa等[10]用重组的慢病毒来表达靶向于NS5B的 shRNA,导入到感染1b型HCV细胞中发现病毒的复制受到极大的抑制,此外,合成的靶向于NS3的siRNA也对1b型 HCV的复制起到明显的抑制作用,这种抑制效应呈现剂量依赖关系[10]。这不仅说明了靶向于NS5B的RNA干扰可用于抗病毒分子治疗,同时也预示着由病毒载体介导的靶向于NS3的发卡RNA也将成为抗1b型HCV感染的重要治疗手段。然而由于病毒基因组序列的高突变性,使这种依赖于高度序列匹配性的分子治疗常常在治疗几次后逐渐失去了治疗效果[11]。与此同时,研究发现位于NS5B编码区的茎-环结构 (stem-loop)作为顺式复制元件在HCV复制过程中发挥着重要作用。Zhang等[12]发现用与NS5B编码区茎环结构高度相似的小RNA分子作为诱饵可竞争性地与调节蛋白结合,通过抑制病毒组中某些重要基因的表达,进而抑制病毒的复制。研究进一步发现,由腺病毒介导的能够精确编码茎-环结构的 RNA(SL RNA)在 Huh-7细胞中可显著封闭 HCV的复制,特别是来自2a型 HCV的SL RNA还能够抑制1b型 HCV的复制,呈现出广泛的抗病毒效果[12]。

1.3 宿主细胞靶向性干扰治疗 除了病毒基因组外,宿主细胞所表达的与病毒感染相关的细胞因子也可以作为分子治疗的重要靶点。研究表明诸如CD81、糖胺聚糖、清道夫受体B族 (SR-B I)、低密度脂蛋白受体、树突状细胞表面的特异性细胞间黏附因子3结合非整合素分子 (DC-SIGN)以及人类紧密连接分子occludin等细胞相关因子在 HCV进入宿主细胞的不同阶段发挥着重要作用[13-14]。研究还发现F-box富含亮氨酸重复蛋白2(FBL-2)、囊泡相关膜蛋白相关蛋白A(VAPA)和B(VAP-B)、FK506结合蛋白8以及热休克蛋白等细胞因子在病毒的复制过程中发挥着重要作用。与病毒基因组相比,这些潜在的治疗靶点有一个显著的优势就是突变率较低,所以,靶向于这些位点的分子治疗更易于逃脱由突变引起的抗性,进行持久的治疗。

CD81是表达在绝大多数人类细胞表面的一种跨膜非糖基化蛋白,缘于和 HCV E2蛋白结合而被认为是 HCV进入细胞的主要受体。Koutsoudakis等[15]用RNA干扰的方法调节CD81在 Huh-7细胞表面的表达,结果显示 CD81的数量在HCV感染过程中发挥着重要作用。同时细胞感染 HCV的敏感性也依赖于CD81的数量,在低量表达CD81时,HCV的感染明显受到限制。Meuleman等[16]用CD81的抗体来处理人源化的uPA-SCID大鼠,发现能够抵抗各种 HCV病毒菌株的攻击,而对已经感染 HCV的大鼠来说却没有影响。这些充分说明细胞表面的CD81是 HCV进入宿主细胞的关键决定因子。此外,在其他细胞相关因子中,清道夫受体B族 (SR-B I)也常为研究热点。研究显示通过RNA干扰的方法下调90%SR-BI在 Huh-7细胞表面的表达,可抑制30%～90%HCV的感染,这种抑制率通常是由 HCV的基因型决定的[17]。

RNA干扰还能与干扰素联合进行抗病毒治疗。RNA干扰通过直接抑制病毒的进入、复制而发挥抗病毒效果;干扰素则是通过激活体内引起抗病毒反应的基因而间接发挥作用。抗病毒机制的互补性,使二者联合用于抗病毒治疗成为可能。Pan等[18]用慢病毒介导RNA干扰与干扰素α联合进行抗病毒治疗,结果显示干扰素治疗不会影响病毒载体的转染效率,也不会影响RNA干扰对目标基因的沉默,而且表现出协同治疗效果。因此,RNA干扰的分子治疗与干扰素联合治疗必将成为更加安全有效的抗HCV感染的治疗方法。

2 基于microRNA的抗病毒分子治疗

2.1 microRNA的作用机制 microRNA(miRNA)主要是通过5′端的前2～8个核苷酸种子序列(seed sequence)识别m RNA 3′端非翻译区 (3′U TR)来实现在转录后水平上调节基因的表达。根据匹配完美程度的不同,miRNA调节基因的表达主要通过以下2种途径:(1)不完全匹配,翻译被抑制而不影响m RNA的稳定性;(2)完全匹配,m RNA被切割进而下调基因表达。此外,miRNA还可以通过指导其靶向基因的 m RNA快速脱腺苷化,进而导致 m RNA的快速衰减和表达水平的降低[19]。

2.2 miRNA与 HCV的复制和翻译 来至宿主细胞的miRNA,特别是肝脏特异性的 miRNA:miRNA-122在 HCV的复制和翻译过程中发挥着重要的调节作用。Jopling等[20]研究显示miRNA-122通过靶向于 HCV基因组 5′NCR能够促进HCV的复制,他们发现 HCV只能在表达 miRNA-122的Huh-7细胞中复制,而不能在不表达miRNA-122的 Hep G2细胞中复制。研究进一步显示miRNA-122在 HCV基因组中的结合位点对于 HCV的复制调节有着非常重要的作用[21]。实验表明当把miRNA-122的结合位点插入到基因组的3′NCR,m RNA的表达会明显下调,而 miRNA-122与位于5′NCR的结合位点相互作用时,病毒的复制明显增加[21]。

此外,miRNA-122还可以通过下调血红素加氧酶1(HO-1)间接地促进 HCV的复制[22],因为 HO-1能够抑制 HCV的复制[23]。与此同时,HCV RNA的翻译也与 miRNA-122相关。封闭miRNA-122后,HCV的翻译明显减少,而在肝细胞中重新加入 miRNA-122后则能显著促进 HCV RNA的翻译[24]。进一步研究显示 miRNA-122是通过增强核糖体与RNA在翻译起始阶段的相互作用来促进 HCV RNA的翻译[24]。

在其他宿主-miRNAs中,与 HCV基因组有相似序列的miR-199a＊也与 HCV的复制有关。M urakami等[25]研究发现,在感染 HCV-1b或-2a型的细胞中过量表达 miR-199a＊能抑制 HCV的复制,而通过反义寡核苷酸封闭miR-199a＊后,病毒的复制明显加速。由此可见,miR-199a＊可作为 HCV复制的抑制剂而被用于抗病毒分子治疗。

2.3 基于miRNA的抗病毒治疗 研究表明抑制miRNA-122的功能往往能够得到良好的抗病毒治疗效果。Shan等[22]通过在感染 HCV的 Huh-7细胞中转染miRNA-122拮抗剂可使HCV减少84%。现在,用于沉默miRNA-122拮抗剂主要是反义寡核苷酸 (ASO)的修饰物。据报道,2′-甲氧乙基-磷酸酰(MOE)修饰物能够在肝脏内显著抑制 miRNA-122的活力,锁核酸 (LNA)修饰的ASO作为一种改进策略能够更好地封闭miRNA-122的功能。与miRNA-122恰恰相反,miR-199a＊则表现出抑制 HCV复制的调节效应,在靶细胞中过量表达miR-199a＊应该是一种比较合理的抗病毒治疗方法。作为调节分子,miRNA确切的生理功能尚未完全搞清楚,但作为一种高效、安全、特异性的抗病毒治疗方法,miRNA在不久的将来一定能够得到广泛的应用。

3 结果与展望

探索HCV生活周期以及其与宿主细胞相关因子之间的相互作用开阔新药研发的视野,人们发现了许多可用于抗病毒分子治疗的新靶点。尤其是RNA干扰技术在基因沉默和靶标筛选领域的应用,能够在 HCV感染不同时期不同阶段进行特异性干扰,由此揭示了许多病毒-宿主相互作用的新机制,提供了更多潜在的治疗靶点。

尽管人们在小分子调节物研究方面取得了长足的进展,基于siRNA和miRNA的干扰治疗作为一种新型抗病毒临床治疗方法还有一段相当漫长的道路,尤其是miRNA的干扰治疗。首先,必须详尽地阐明miRNA具体调节机制以及其在生命周期中的生理功能,进而揭示更多潜在的治疗靶点以及其用药的安全性、可靠性、准确性。其次,HCV的高突变性常常使干扰治疗因病毒产生抗性而在多次给药后失去治疗效果,因此,筛选到一个或几个高度保守的治疗靶点乃是抗病毒治疗取得成功的关键。相信随着研究的不断深入,RNA干扰作为一种新型抗病毒治疗方法一定能展示出其诱人的 HCV临床治疗效果。

[1] 许瑞安,陈凌,肖卫东.分子基因药物学[M].北京:北京大学医学出版社,2008:246.

[2]罗茜,吴永忠.RNA干扰技术在卵巢癌研究中的进展[J].重庆医学,2009,38(17):2247.

[3] Pan QW,Henry SD,Scholte BJ,et al.New therapeutic opportunities for hepatitis C based on small RNA[J].Wo rld J Gastroenterol,2007,13(33):4431.

[4]Prabhu R,Garry RF,Dash S.Small interfering RNA targeted to stem-loop IIof the 5′untranslated region effectively inhibits exp ression of six HCV geno types[J].Virol J,2006,3(1):100.

[5] Ilves H,Kaspar RL,Wang Q,et al.Inhibition of hepatitis C IRES-mediated gene exp ression by small hairpin RNA s in human hepatocytes and mice[J].Ann N Y Acad Sci,2006,1082:52.

[6] Kanda T,Steele R,Ray R,et al.Small interfering RNA targeted to hepatitis C virus 5′nontranslated region exerts potent antiviral effect[J].J Virol,2007,81(2):669.

[7]Meng S,Wei BJ,Xu RH,et al.TA T Pep tides mediated small interfering RNA delivery to Huh-7 cells and efficiently inhibited hepatitis C virus RNA rep lication[J].Intervirology,2009,52(3):135.

[8] Gamble C,Trotard M,Le Seyec J,et al.Antiviral effect of ribonuclease conjugated oligodeoxynucleo tides targeting the IRES RNA of the hepatitis C virus[J].Bioo rg Med Chem Lett,2009,19(13):3581.

[9]M ccaffrey AP,Meuse L,Pham T,et al.Gene exp ression-RNA interference in adult mice[J].Nature,2002,418(6893):38.

[10]Takigawa Y,Nagano-Fujii M,Deng L,et al.Supp ression of hepatitis C virus replicon by RNA interference directed against the NS3 and NS5B regions of the viral genome[J].M icrobiol Immunol,2004,48(8):591.

[11]Wilson JA,Richardson CD.Hepatitis C virus rep licons escape RNA interference induced by a short interferingRNA directed against the NS5b coding region[J].J Virol,2005,79(11):7050.

[12]Zhang J,Yamada O,Sakamoto T,et al.Inhibition of hepatitis C virus replication by pol III-directed overexp ression of RNA decoys co rresponding to stem-loop structures in the NS5B coding region[J].Virology,2005,342(2):276.

[13]Ploss A,Evans MJ,Gaysinskaya VA,et al.Human occludin is a hepatitis C virus entry factor required fo r infection of mouse cells[J].Nature,2009,457(7231):882.

[14]Lanford RE,Evans MJ,Lohmann V,et al.The accelerating pace of HCV research:a summary of the 15th international symposium on hepatitis C virus and related viruses[J].Gastroenterology,2009,136(1):9.

[15]Koutsoudakis G,Herrmann E,Kallis S,et al.The level of CD81 cell surface exp ression isa key determinant for p roductive entry of hepatitis C virus into host cells[J].J Virol,2007,81(2):588.

[16]Meuleman P,Hesselgesser J,Paulson M,et al.Anti-CD81 antibodies can p revent a hepatitis C virus infection in vivo[J].Hepatology,2008,48(6):1761.

[17]Lavillette D,Mo rice Y,Germanidis G,et al.Human serum facilitates hepatitis C virus infection,and neutralizing responses inversely co rrelate w ith viral rep lication kinetics at the acute phase of hepatitis C virus infection[J].J Virol,2005,79(10):6023.

[18]Pan Q,Henry SD,Metselaar HJ,et al.Combined antiviral activity of interferon-αand RNA interference directed against hepatitis C without affecting vecto r delivery and gene silencing[J].JMol Med,2009,87(7):713.

[19]Wu L,Fan J,Belasco JG.M icroRNAs direct rapid deadenylation of m RNA[J].Proc Natl Acad Sci,2006,103(11):4034.

[20]Jop ling CL,Yi M K,Lancaster AM,et al.Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA[J].Science,2005,309:1577.

[21]Jopling CL,Schütz S,Sarnow P.Position-dependent function for a tandem microRNA miR-122-binding site located in the hepatitis C virus RNA genome[J].Cell Host Microbe,2008,4(1):77.

[22]Shan Y,Zheng J,Lambrecht RW,et al.Recip rocal effects of micro-RNA-122 on exp ression of heme oxygenase-1 and hepatitis C virus genes in human hepatocytes[J].Gastroenterology,2007,133(4):1166.

[23]Zhu Z,Wilson A T,Mathahs MM,et al.Heme oxygenase-1 supp resses hepatitis C virus rep lication and increases resistance of hepatocytes to oxidant injury[J].Hepatology,2008,48(5):1430.

[24]Henke JI,Goergen D,Zheng J,et al.MicroRNA-122 stimulates translation of hepatitis C virus RNA[J].Embo J,2008,27(24):3300.

[25]M urakami Y,A ly HH,Tajima A,et al.Regulation of the hepatitis C virus genome rep lication by miR-199a[J].J Hepatol,2009,50(3):453.

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