软体动物免疫功能研究进展*

彭怀明,周书林

(皖南医学院医学寄生虫学教研室,安徽芜湖 241000)

软体动物免疫功能研究进展*

彭怀明,周书林*

(皖南医学院医学寄生虫学教研室,安徽芜湖 241000)

软体动物的免疫主要由细胞免疫和体液免疫组成。细胞免疫功能的完成主要依靠吞噬作用,体液免疫则主要以凝集素、抗菌肽、溶菌酶、酚氧化酶等诸多非特异性免疫因子的综合作用而完成。近年来,国内外对软体动物的免疫功能作了大量的研究,特别是在上述诸多非特异性免疫因子在软体动物体内的定位、分类、免疫功能及其机制的研究有了较大的进展。论文就现有的研究结果对软体动的免疫功能做一概述。

软体动物;细胞免疫;体液免疫

免疫学作为一门自然科学,只有100年左右的历史,作为一门独立的学科,也只有几十年。与脊椎动物相比,有关软体动物免疫方面的研究工作报道较少。在医学领域,有许多寄生虫的中间宿主就属于软体动物门,为了更好地做好寄生虫的预防工作,深入地了解软体动物的免疫功能显得非常重要。随着分子生物学、细胞生物学、分子遗传学和生物高技术等诸多学科的发展,免疫学的基本理论和操作技术获得了深入的发展,软体动物免疫功能机制的研究得以进一步的深入,血淋巴细胞的分类趋于更合理、科学,其在免疫中的作用机制阐明得更深刻,在探索新的体液免疫因素的同时对已知因素的研究更加系统化,特别是在参与体液免疫的凝集素、抗菌肽、溶菌酶、酚氧化酶等诸多非特异性免疫因素在软体动物体内的定位、分类、免疫功能及其免疫机制的研究有了较大的进展。

一般认为,软体动物免疫与哺乳动物免疫机制相似,主要包括细胞免疫和体液免疫[1]。

1 细胞免疫

血淋巴是软体动物的免疫系统的核心组分,其中血细胞既是细胞免疫的承担者,又是体液免疫因子的提供者,还参与了机体损伤的修复、贝壳的重建、吞噬异物颗粒和消除有毒物质等过程,是其免疫的主要承担者[2]。从异物入侵软体动物机体开始直至异物被吞噬和消化的整个过程,都需要血淋巴和血细胞中很多物质的参与。有研究表明,血细胞以其膜上具有很多特殊的受体而有别于其他的体细胞,细胞的表面特征直接影响其对异物的消除速率[3]。Lacoste A等[4]研究表明牡蛎血细胞表面存在β肾上腺素能受体。

一般来讲软体动物的细胞免疫主要通过血细胞的吞噬作用完成。吞噬的整个过程主要为趋化、黏着、识别、内吞和消化。软体动物的血细胞一般可以分为颗粒细胞和透明细胞[5],颗粒细胞相对较大,电镜下胞内可见丰富的颗粒,而透明细胞则相对较小,胞内没有或仅含少量的颗粒[1]。大多数学者在对软体动物血细胞进行研究都按此进行总的分类,在此基础上根据细胞的电镜结构、胞内物质在免疫中的作用、胞内物质的酶学特征等将血细胞进行更细的分类。在软体动物免疫过程中发挥吞噬作用的主要是颗粒细胞,它对多种病原体和外来颗粒有强的吞噬作用。而透明细胞在软体动物的伤口修复中发挥着关键作用,它能清理组织碎片,阻止血液继续外流,同时其分泌的细胞外基质是上皮细胞再生的模板。

在软体动物的免疫过程中,颗粒细胞对吞噬后的病原体的杀伤作用主要有溶酶体酶(lysosomal enzyme)和呼吸爆发(respiratory burst)两条途径。颗粒细胞将外源颗粒内化后形成吞噬小体,然后吞噬小体与含有溶酶体酶的胞质颗粒融合,逐步将外源颗粒水解消化;同时细胞在吞噬时激活了呼吸爆发,产生了大量可杀伤微小有机体的含活性氧的化合物(reactive oxygen species,ROS)。此过程中产生的ROS包括超氧化物自由基(superoxides)、过氧化氢(hydrogen peroxide)、羟基自由基(hydroxyl radicals)、单线态氧(singlet oxygen)等[1]。ROS对入侵的病原体有很强的杀伤作用,但与此同时它对宿主也有伤害,宿主对这类物质的消除主要靠超氧化物岐化酶的降解作用。颗粒细胞内的不同颗粒在免疫中有着不同的功能,张维翥等[6]根据海湾扇贝颗粒细胞的电镜特征颗粒细胞中的颗粒区分成3种类型,即Ⅰ型高电子密度颗粒,Ⅱ型低电子密度颗粒和Ⅲ型中等电子密度颗粒,并推测I型高电子密度颗粒是细胞吞噬的异物(微生物等)或胞内的废物(沉积颗粒,衰老的胞器或碎片);Ⅱ型低电子密度颗粒是溶酶体类的胞内分泌颗粒,来源于高尔基复合体或内质网;Ⅲ型中等电子密度颗粒可能是次级溶酶体,由Ⅰ型和Ⅱ型颗粒融合或Ⅰ型颗粒被溶入裂解酶类后而形成。

研究还发现,软体动物具有吞噬活性的血细胞具有哺乳动物细胞因子的免疫反应存在,这些细胞因子可影响血细胞的移动、细菌吞噬、诱导和生物胺的释放,从而参与软体动物免疫神经内分泌应答的调节[5]。其具体的免疫机制还在进一步的研究中。

2 体液免疫

对于软体动物而言,一般认为其缺乏免疫球蛋白,其体液免疫主要是依靠血清中的一些非特异性的酶或免疫因子来发挥作用的。Zhang S M等[7]、胡晓等[8]的研究表明软体动物存在类似高等动物免疫球蛋白的类抗体,但其在免疫功能中的发挥的作用及具体机制还在进一步的研究中。软体动物的体液免疫功能的研究近年来在凝集素、抗菌肽、溶菌酶、酚氧化酶等各种非特异性的酶和免疫因子方面有了一定的进展。

2.1 凝集素

凝集素广泛存在于植物、动物及微生物体内,是指所有非免疫原的能凝集细胞或沉淀含糖大分子的蛋白质或糖蛋白,能专一、非共价、可逆地与糖结合,选择性地凝集脊椎动物血细胞、某些微生物细胞和单细胞藻类。凝集素是无脊椎动物的重要免疫因子,广泛存在于软体动物的细胞外基质中,如蛋白腺、血淋巴液、体表黏液、肌肉等,还存在于血淋巴细胞表面、细胞基质甚至细胞核中,构成机体免疫防御的第一道防线,在免疫应答早期阶段发挥着积极的作用[9]。

由于软体动物不具备特异性免疫系统,缺乏特异性免疫识别分子,因此包括凝集素在内的模式识别分子(pattern recognition molecule,PRM)在软体动物的免疫识别中起着极其重要的作用。凝集素在软体动物免疫反应中的首要作用是能对入侵机体的异源性物质进行识别。作为结合糖的蛋白,一种凝集素一般只与一种糖基结合,即其结合具有专一性,能识别糖蛋白和糖脂是它最大的特点,特别是能够识别蛋白质或脂类物质携带的特定碳水化合物基团,即细胞膜表面的糖基[10]。软体动物体表黏液和体液中的凝集素通过对异物表面的糖基分子进行识别、结合,进而使之发生凝集、失去活动能力,从而阻止其进入软体动物体内或限制其在体内的扩散、繁衍。含有凝集素的血淋巴细胞可通过膜表面凝集素对异物表面糖基分子的识别,直接对异物进行吞噬和清除。同时凝集素对软体动物的血淋巴细胞的吞噬有促进作用,兔红细胞用美洲牡蛎血淋巴液中的凝集素处理后,牡蛎变形细胞对它的吞噬数目可加倍[9]。

软体动物种类繁多,迄今已有100余种贝类凝集素被发现,10多种凝集素被分离和纯化,其中有一些凝集素的蛋白编码基因得到克隆和分析。多数软体动物凝集素在血淋巴液pH为6～8时凝集活力最好,pH大于8或小于6,凝集活性逐渐下降[11]。根据凝集素与糖结合的专一性,凝集素可被分为6类[12]:能与D-甘露糖和(或)D-葡萄糖结合的凝集素;能与2-乙酞氨基-2-脱氧-D-葡萄糖结合的凝集素;能与2-乙酞氨基-2-脱氧-D-半乳糖结合的凝集素;能与D-乳糖结合的凝集素;能与L-岩藻糖结合的凝集素;能与唾液酸结合的凝集素。依此分类方法,目前发现的软体动物血清凝集素基本具备上述所有类型[11]。

2.2 抗菌肽

软体动物内源性抗菌肽在机体抵御病原入侵方面发挥着重要的作用,是软体动物防御的又一重要屏障。抗菌肽是生物体液中具有广谱杀菌、抑制病毒、抑杀肿瘤细胞等作用的一类膜活性多肽。抗菌肽广泛存在于从细菌到哺乳动物的生物界,也是软体动物天然免疫的主要成分,被称为“第二防御体系”或“第二免疫体系”。

抗菌肽作为软体动物天然免疫的一个主要方面,对软体动物的非获得性免疫具有特殊意义:它能通过对细胞分类识别而避免免疫自损,也可通过非宿主微生物的特异性识别完成免疫反应。抗菌肽主要以活性的形式存在于颗粒细胞中,当病原微生物入侵时,分泌到细胞表面,这不需要经典的免疫反应的复杂过程,直接发挥抗菌作用,使生物体在很短的时间内能够同时杀灭两种或两种以上的入侵病原体[13]。软体动物抗菌肽的种类繁多,作用机理不尽相同,人们普遍接受的是抗菌肽可以与病原体的细胞膜作用,增加膜的渗透性,从而导致病原体的死亡。抗菌肽中的线形亲水脂的α-螺旋分子,主要通过阳离子与细胞膜上的阴离子相互作用,从而破坏细胞膜的完整性;富含半胱氨酸残基的分子,则是在磷脂膜上通过形成离子通道增加细胞膜的通透性;另外的一些分子还可以进入细胞内,直接与DNA、RNA作用,导致细胞死亡。

根据结构特征,有学者将无脊椎动物抗菌肽分为以下 3种[14]:①形成α-螺旋结构的线形多肽;②富含半胱氨酸残基,包含一个或多个二硫键的多肽;③富含某些特殊氨基酸(如 Pro、Gly、His)的分子。在软体动物抗菌肽中研究得较多是贻贝等海洋软体动物的防御素。迄今发现的防御素大多数分子质量较小,呈阳离子性、α-螺旋结构,富含半胱氨酸。根据其初级结构、性质和共有的半胱氨酸序列,分子中共有半胱氨酸序列的数量,分为4类,即防卫素(mytilus defensins,MDs)、myticins(myticin A,myticin B)、Mytilins和 Mytimycin,其中 MDs包括来自紫贻贝的MD A和MD B以及来自地中海贻贝的MGD1和MGD2[15]。Mitta G等[16]的研究表明,地中海贻贝在血细胞中合成的贻贝前体以活跃的形式储存在颗粒细胞中,可对入侵该细胞的细菌直接起作用,Myticin A对G+细菌的抗性大于G-细菌,它能使遭遇到的细菌在几秒钟内胞质膜的通透性出现障碍而瓦解,部分去极化,膜质ATP减少,呼吸受抑制直至死亡。

2.3 溶菌酶

溶菌酶,其化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,又称胞壁质酶,是非特异性免疫系统的重要成员。它是软体动物中研究最多的溶酶体酶,在软体动物的许多组织器官,尤其是产卵器官、消化腺、足丝腺和外套膜分泌液中广泛存在[17]。

溶菌酶对细菌的杀伤作用主要是因为它能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的α-1,4糖苷键之间的联结,引起肽聚糖支架的破坏,在内部渗透压的作用下细胞胀裂,从而引起细菌裂解[18]。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖,故一般来讲溶菌酶对人体细胞无毒性作用。它是软体动物体内重要的非特异免疫因子之一,在其免疫过程中不仅能水解破坏细菌的细胞壁而致细菌溶解死亡,还可诱导调节其他免疫因子的合成与分泌。溶菌酶水解细胞壁时所释放的肽聚糖碎片同时也是合成各种抗菌蛋白包括溶菌酶的诱导物,溶菌酶还可清除其它抗菌因子作用后所残余的细菌细胞壁并可增强其他免疫因子的抗菌敏感性,协同其他免疫因子共同抵制外来致病微生物的入侵[19]

通常溶菌酶按其氨基酸序列的差异可分为6类,即鸡蛋清溶菌酶(c-型)、鹅溶菌酶(g-型)、噬菌体溶菌酶(p-型)、无脊椎动物溶菌酶(i-型)、植物溶菌酶和细菌溶菌酶。其中,c-型溶菌酶分布最广泛,脊椎动物与无脊椎动物中均存在,包括钙结合溶菌酶和非钙结合溶菌酶两种亚型。系统进化树分析显示,溶菌酶的i-型与c-型的进化距离较远[20],i-型溶菌酶可能起源于一个独立的家族[21]。软体动物为无脊椎动物,一般以i-型为主。Bachali S等[20]从海产冰岛栉孔扇贝(Chlamy sislandica)的内脏中分离到的i-型溶菌酶,能有效抑制革兰阳性与阴性菌的生长,但只能在pH 4.5～6.2和4℃～35℃的条件下才能高效水解微球菌。

2.4 酚氧化酶

酚氧化酶是黑色素形成的关键酶,由黑化反应形成的色素沉着对有机体起到保护作用。一般认为酚氧化酶主要存在于软体动物的血淋巴中。周书林[22]用荧光组织化学染色法对钉螺酚氧化酶进行定位,结果显示雌雄钉螺均存在酚氧化酶,且定位于肝脏。

酚氧化酶在软体动物体内可通过多种方式参与免疫反应,包括提供调理素,促进血细胞吞噬作用、包囊作用和结节形成,介导凝集和凝固、产生杀菌物质等功能,是软体动物免疫中不可或缺的一种酶[23]。研究表明,软体动物直接参与免疫反应的系统是酚氧化酶原激活系统。酚氧化酶原在其激活酶(一种丝氨酸蛋白酶)的作用下转变成有活性的酚氧化酶。当软体动物机体受到病原微生物或寄生虫等侵害后,异物的结构成分,如细胞壁葡聚糖或脂糖等,作为非己信号按一定顺序激活丝蛋白酶,丝氨酸蛋白酶随后又激活酚氧化酶原。酚氧化酶能够催化酪氨酸及儿茶酚类物质氧化成醌类,并进一步转化成黑色素,沉积在包囊内部及周围,从而促进吞噬作用。这些中间产物能抑制细菌和菌丝的酶活性,并引起细胞溶解和细胞毒效应。

3 软体动物的免疫调节及免疫影响因素

对于软体动物的机体免疫的调节,目前的研究尚不能明确其系统化的机制,但对于其部分免疫物质的调节机制有了一定的进展。化学递质是一类在免疫细胞之间和神经内分泌系统与免疫系统之间介导免疫应答的物质。在软体动物的免疫研究中,化学递质作为一个新的领域正引起越来越多的关注。软体动物的化学递质存在于其的体液和血细胞中,主要包括去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)、促肾上腺皮质素释放素(corticotropin-releasing hormone)、阿片样活性肽(opioid peptides)和蛋白激酶(protein kinase,PK)等化学活性物质[24]。NA是儿茶酚胺在软体动物血淋巴内存在的主要形式,能降低氧自由基的含量。用NA处理后的太平洋牡蛎血细胞化学发光的应答明显受抑制,表明牡蛎血细胞表面存在β肾上腺素能受体,可以对化学发光进行负调节[4]。陈振英等[25]的研究则证实不同浓度的阿片样肽对贝类免疫的作用不一样,阿片样活性肽主要通过免疫细胞表面的受体介导免疫信号的传导而影响免疫系统,其作用效果受到受体数量和体液中的各种调理素的影响。

软体动物机体相对开放且非特异性免疫的机制简单,对生活环境中各种因子的改变高度敏感。环境因子对软体动物免疫系统中的细胞免疫和体液免疫都会造成影响。Monari M 等[26]研究证实,当水环境中的温度急剧或缓慢升高时,贝类的血细胞浓度升高而吞噬活性下降。温度对细胞免疫的改变可能是通过改变细胞表面的受体实现的。生物因子对贝类免疫的改变也是很显著的,软体动物体液中的ACP、AKP活力在病原菌的入侵后显著升高,这种变化可能是血细胞的破坏造成溶酶体的释放。

某些外源多糖对软体动物的免疫有增强作用。杨文鸽等[27]用β-1,3-葡聚糖及其羧甲基衍生物注入海湾扇贝(Argopecten irradians)后测定其血清蛋白含量及血清和血细胞中酚氧化酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶活力,结果显示所测指标有不同程度的增高,说明了β-1,3-葡聚糖及其羧甲基衍生物可增强海湾扇贝的免疫力。

4 结语

一般认为软体动物机体相对开放,缺乏脊椎动物的特异性免疫系统,其免疫主要靠先天性、非特异性免疫,显得相对直接、原始。软体动物的类抗体等免疫因子的发现和与哺乳动物补体系统相似的调理素的研究说明:在进化过程中软体动物的免疫系统也在向脊椎动物接进,即免疫进化的趋同效应。随着各类已知免疫因子的免疫机制的进一步阐明,对软体动物的免疫功能的认识正趋向于系统化。科技的发展,必将带动软体动物的免疫的各种机制研究的深入。这不仅可以为贝类养殖病虫害的防治提供有力的保障,同时也可为以各类软体动物为寄生宿主的寄生虫研究提供宝贵的资料。

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Progress on Immune Function of Molluscs

PENG Huai-ming,ZHOU Shu-lin

(Divisionof Medical and Parasitology,Wannan Medical College,Wuhu,Anhui,241000,China)

The immune system of molluscs comprises cellular immunity,which is the major defendense carried out by hemocyto phagocytosis to eliminate foreign invasions,and humoral immunity,whose function is mediated by some nonspecific immune factors in hemolymph,such as lectin,antimicrobial peptide,lysozyme,and phenol oxidase.Recently,the increasing achievements were made on the classification,tissue location and function identification of these immune components in molluscs.Here,we reviewed the general features of some identified immune components in molluscs and introduced current advances in the research of the mollusc immunity.

mollusc;cellular immunity;humoral immunity

S852.4

A

1007-5038(2010)08-0079-05

2010-02-19

资金项目:安徽省教育厅自然科学基金(kj2009B152)

彭怀明(1976-),男,江苏建湖人,主治医师,硕士研究生,主要从事寄生虫组织化学研究。*通讯作者