杯状病毒受体研究进展*

陈 柳,刘光清,宋 毅,3,倪 征,余 斌,华炯钢,李双茂,云 涛*

(1.浙江省农业科学院农业部病毒学与生物技术重点实验室,浙江杭州310021;2.中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;3.浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004)

杯状病毒(Caliciviruses)呈球形或近球形,直径30 nm～35 nm,无囊膜,核衣壳呈二十面体对称。杯状病毒科病毒包括4个属,分别为兔病毒属(Lagovirus),代表种为兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV);诺瓦病毒属(Norovirus),代表种为诺瓦克病毒(Norwalk virus,NoV);扎幌病毒属(Sappovirus),代表种为扎幌病毒(Sapporovirus)及水疱疹病毒属(Vesivirus),以猪水疱疹病毒(Vesicular exanthema of swine virus,VESV)为代表种。杯状病毒的基因组结构很相似,基因组长约7.4 kb～7.7 kb,含有2个～4个开放阅读框(open reading frame,ORF),其中,Ⅱ和Ⅲ型扎幌病毒和RHDV含有2个ORF(ORF1、ORF2),Ⅰ型、Ⅳ型和Ⅴ型扎幌病毒、诺瓦克病毒和猫杯状病毒含有3个ORF(ORF1、ORF2、ORF3),在南安普顿病毒(Southampton virus,SV)基因组中还发现了ORF4,位于ORF2和ORF3之间。虽然ORFs组成不同,但编码出的结构蛋白都仅有衣壳蛋白和次结构蛋白两种。除了全长基因组以外,在杯状病毒颗粒中还有许多丰富的亚基因组mRNA分子,其大小约2.2 kb～2.4 kb。亚基因组中含有衣壳蛋白的编码序列,可以翻译出具有自聚合能力的衣壳蛋白。不同杯状病毒的衣壳蛋白具有较高的氨基酸序列同源性,尤其在氨基端和羧基端,且在衣壳蛋白中都含有一个大约250个氨基酸的保守序列,该区域在病毒的复制或病毒颗粒装配中发挥重要作用[1]。杯状病毒衣壳蛋白不仅在病毒装配、病毒免疫、而且在病毒识别、侵入宿主过程中起着重要的作用。

杯状病毒科病毒具有较广的宿主范围,能引起多种动物和人类疾病。侵入宿主细胞是病毒进行感染的首要环节,杯状病毒首先需要与受体结合,之后通过细胞内吞作用进入细胞。由于该科病毒除水疱疹病毒属的VESV、猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)和圣米吉尔海狮病毒(San Miguel sea-lion virus,SMSV)外,没有很好的体外培养体系,制约了对该科病毒的研究。关于杯状病毒受体的研究,目前只在少数几个种属中取得了一定进展。

1 碳水化合物受体

1.1 组织血型抗原

杯状病毒科的很多病毒能够识别宿主细胞和组织的血型抗原,包括A、B、H和Lewis型组织血型抗原(HBGAs)。RHDV能识别成年兔体上呼吸道及消化道上皮细胞表面的HBGAs-H2,病毒识别并结合HBGAs从而启动病毒对机体的入侵,而L-岩藻糖是RHDV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)识别HBGAs的最基本结构[2-3]。杯状病毒中与HBGAs结合研究的比较透彻的是人诺瓦克病毒,曾玫等写了较为详尽的综述[4]。Marionneau S等[5]首次报道重组诺瓦克病毒样颗粒(rNoVVLPs)可识别Se+人体胃十二指肠上皮细胞的H1和H3/4抗原,Huang P等[6]研究了不同诺瓦克病毒毒株衣壳蛋白与人唾液HBGAs的结合情况,发现不同毒株识别不同的HBGAs,目前至少发现了4种结合模式,其中3种模式的NoVs(VA387、NV和MOH)识别分泌型血型组织抗原,而另一种NoV(VA207)识别Lewis阳性的非分泌型。Tan M等[7]通过多序列比对、同源模拟、及对NoV衣壳蛋白进行结构分析,初步确定P2区袋状样结构与HBGAs结合有关,结合袋底部包含一个保守的RGD/K样motif和3个环绕四周的特异氨基酸位点,且不同毒株的这些位点不同(VA387株为N302、T337、Q375;MOH株为N302、N338、E378),定点突变试验进一步证实以上4个位点对病毒与受体结合有重要作用。Tan M等[8]又进一步用3种不同结合模式的NoVs病毒株(NV、VA387和MOH)证实完整的P区对于病毒与HBGAs特异性结合是必要的,研究发现P区独立表达时虽不能形成VLPs,但可形成二聚体,其与HBGAs结合模式和完整病毒衣壳相同;相反,S区能形成小的薄层VLPs,但不与A、B或H HBGAs结合。Tan M等[9]进一步研究了P区构象对受体亲和性的影响,发现P区铰链结构的存在与否起着至关重要的作用,如果VA387 P区含铰链结构时主要形成二聚体,与HBGAs亲和性较低,一旦P区铰链结构去除形成T=1的二十面体P粒子,其受体亲和力较P二聚体增强至少700倍,可与VLP相比。

1.2 唾液酸

对于杯状病毒细胞受体的研究,主要集中于能在体外进行高滴度培养的FCV。Kreutz L C等[10]发现FCV对氯奎比较敏感,提示酸化环境是病毒感染细胞所必需的。之后,Stuart A D等[11]进一步证实,FCV经内涵素介导的细胞内吞作用感染细胞,且细胞质内的酸化环境有利于病毒基因组脱壳后进入细胞质。又有研究发现用蛋白酶处理Crandell-Reese猫肾细胞系(crandell-reese feline kidney,CRFK)能够增加FCV与之结合,而磷酸酯酶对FCV与细胞结合没有任何影响。相反,预先用神经氨酸苷酶处理,之后用O-寡糖酶处理的细胞与病毒结合能力大大减弱。这些研究表明,FCV的细胞受体含有功能重要的碳水化合物组分[12]。Stuart A D等[13]通过化学试剂和酶处理对宿主细胞表面某些成分进行阻断,发现FCV能够识别细胞表面一种N-连接糖基化蛋白的α2,6-唾液酸糖基成分。近几年来,发现鼠诺瓦克病毒(Murine norovirus-1,MNV-1)能够很好地在鼠巨噬细胞及树状突细胞中增殖,基于该病毒体外培养模型,Taube S等[14]对MNV-1的细胞受体进行了初步探讨,研究发现,用唾液酸结合物凝集素以及神经氨酸酶处理能减少Ⅰ型鼠诺瓦克病毒(MNV-1)对鼠巨噬细胞的感染,说明唾液酸在MNV-1的吸附与感染宿主中起着重要的作用。因为唾液酸能吸附神经节苷脂等糖脂,作者进一步探讨了鼠巨噬细胞表面存在的3种神经节苷脂(GD1a,GM1和唾液酸基缺乏的GM1(GA1))在MNV-1感染巨噬细胞中的作用,结果表明,MNV-1只能结合GD1a而不与另外两种神经节苷脂结合,用葡糖基神经酰胺酶合成酶抑制剂(D-thero-P4)处理巨噬细胞,发现MNV-1对处理之后的细胞的感染能力下降,而向培养的该细胞中加入GD1a能恢复MNV-1对该巨噬细胞的感染。这些现象对其它的两株病毒株也同样适用。以上研究说明MNV能用巨噬细胞表面位于神经节苷脂末端的唾液酸作为细胞受体。

1.3 硫酸乙酰肝素

Tamura M以杆状病毒表达系统表达获得的NoV病毒样颗粒VLPs为材料,对NoV VLPs与细胞表面硫酸乙酰肝素的结合特性进行了研究,发现肝素和苏拉明(一种高度硫酸化的尿素衍生物)能有效地阻断VLPs与哺乳细胞表面的结合,且一些已知的能与细胞表面硫酸乙酰肝素结合的试剂和能降解硫酸乙酰肝素的酶类能大大降低VLPs与细胞的结合,进一步用马来酸氯苯那敏片处理细胞发现硫酸乙酰肝素的硫酸化修饰对其与VLPs结合起关键作用[15]。

2 细胞蛋白受体

除了能以唾液酸作为细胞受体之外,近年来几个工作组又鉴定出了FCV其他的功能性受体并对其进行了深入的研究,Makino A等[16]从CRFK细胞的cDNA文库中调出了能与FCV F4毒株结合的细胞黏附蛋白JAM-A,抗JAM-A抗体能够阻断FCV感染CRFK细胞,同时猫JAM-A(feline JAMA,fJAM-A)分子在FCV非敏感仓鼠肺细胞中的表达能使FCV F4毒株及其他几株测试株感染该细胞,说明fJAM-A是FCV的一种功能性受体分子。对fJAM-A分子的不同区域与FCV的结合能力进行分析发现,仅Ig样的细胞外区域D1在与FCV结合过程中是必需的,其他的区域皆能被替代,但用FCV进行细胞感染时,除D1区域外,fJAM-A分子的其他区域也是病毒感染必不可少的。同时,fJAM-A表达于细胞表面并不满足所有该研究所用FCV分离株对细胞的易感性,由此,作者推测fJAM-A蛋白是FCV的辅助受体,除fJAM-A之外,还需要其他因子参与FCV的感染,同时对于不同的分离株,需要不同的因子参与[17]。Bhella D等[18]对FCV衣壳蛋白VP1与fJAM-A分子结合的部位进行了探讨,发现VP1的P2结构域的外表面(含有高可变区及中和抗原表位)参与VP1与fJAM-A的结合,之后,VP1蛋白构象发生改变,启动病毒脱衣壳。由此可见,对于FCV的细胞受体主要集中于两点,一是细胞表面的碳水化合物,二是细胞表面蛋白,FCV侵入宿主细胞是一个多方位的过程,需要多种因素参与。关于NoV细胞蛋白受体的研究,也有零星的报道。T amura M等[19]通过病毒辅覆蛋白印迹技术(virus overlay protein blot assay,VOPBA)发现一个存在于多种哺乳动物细胞系细胞膜上的分子质量为105 ku的膜蛋白能与诺瓦克病毒样颗粒直接相互作用,这种结合不依赖膜蛋白的天然构象,推测该蛋白是病毒的细胞受体,但该蛋白为何种物质尚未得到鉴定。2003年又报道可溶性的组蛋白分子能够阻断诺瓦克病毒感染哺乳动物细胞,H1组蛋白不仅能与诺瓦克病毒粒子结合,而且能结合于宿主细胞[20],该研究结果不仅给病毒受体研究提供了借鉴,而且为抗病毒药物的研发提供了思路。

3 结语

病毒受体的研究一直是病毒学科的热点和难点,而研究方法的选用恰当与否决定了病毒受体的研究进程。除了一些通用的方法如文库筛选、噬菌体表面展示技术、VOPBA、免疫共沉淀技术、克隆表达技术及病毒受体阻断剂的应用等等,针对杯状病毒科病毒的特点还可选用如下几种替代方法:①由于该科病毒大部分缺乏体外培养体系,因此可以采用假病毒体系来替代野生病毒进行受体研究;②杯状病毒衣壳蛋白能自聚合形成VLPs,也可通过表达获得自聚合形成VLPs的衣壳蛋白来代替野生病毒进行受体研究;③病毒受体大多为膜蛋白,常规的酵母双杂交发生于细胞核中,不适合病毒受体的筛选,可以用Split-ubiquitin膜蛋白酵母双杂交系统替代[21-24]。

病毒感染宿主的基本前提是它首先要与宿主细胞表面的受体结合,这种结合不仅决定病毒的致病性,也决定病毒的宿主嗜性范围。杯状病毒细胞受体的阐明将有助于揭示病毒的感染途径及其致病的分子机制,对于深刻理解病毒与宿主细胞的相互关系以及有针对性地研制有效的抗病毒药物、疫苗具有重大的理论与实践意义。更进一步,如果能找到病毒黏附蛋白与病毒受体的结合位点,就可以从封闭病毒的受体结合位点和封闭受体两方面来阻断病毒与受体的结合。

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