基因芯片技术在猪病毒性疾病诊断中的应用*

叶 芬,蔡家利

(1.西南大学动物科技学院,重庆400715;2.重庆理工大学药学与生物工程学院,重庆400050)

混合感染已经成为猪群发病的普遍现象,使病情更为复杂,增加了临床和实验室诊断难度,因此,对多种疫病同时做出诊断,及早制定和采取相应防制措施是现代动物疫病检疫新的发展方向。基因芯片在病原体检测方面具有独特的优势,它以高通量并行检测的方式,可以使病料中的多种病原体同时被检出,具有快速、高效、灵敏的特点,尤其适宜于大规模的样本检测。它为生物学研究提供了高通量的技术手段,已在病原体基因分型、基因表达谱分析、药物筛选等各个领域显示出广阔的应用前景,对于病毒性病原体的检测,已有较多报道[1-3]。但多数研究集中于单病毒的基因分型或少数病毒的低密度基因芯片检测[4],在猪的重大病毒性疾病方面的应用也是如此。

1 基因芯片概述

1.1 基因芯片及其原理

基因芯片的概念来源于计算机芯片,又称为DNA芯片、DNA微阵列。它是由大量已知序列的DNA或者寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列。基因芯片的基本工作原理是经过标记的待测样本DNA通过与芯片上特定位置的探针杂交,可根据碱基互补配对的原理确定靶DNA序列[5]。经过分析处理芯片的杂交检测图像,可以对细胞和组织中大量的基因信息进行分析。基因芯片能够实现生物信息的大规模检测分析,是一种进行DNA序列分析及基因表达信息分析的强有力工具[6]。基因芯片由支持物、连接层和DNA分子探针阵列3部分组成,该项技术主要包括DNA方阵的构建、样品的制备和标记、分子杂交和杂交图谱的检测分析。

1.2 基因芯片技术的分类

基因芯片技术的分类方法很多,最常用的是按载体上所点探针的类型分为2种[7]:①cDNA芯片,由Schena建立,是将特定的cDNA经PCR扩增后借助机械手直接点到基片上;②寡核苷酸芯片,由Fodo首先报道,用照相平板印刷术和固相合成技术在基片上生成寡核苷酸,分为长寡核苷酸芯片和短寡核苷酸芯片。目前,关于不同基因芯片技术的灵敏度和特异性仍存在争议。起初,人们认为长寡核苷酸芯片和cDNA芯片有更高的特异性和灵敏度,现在看来,短寡核苷酸芯片同样有很高的特异性,因为每一个基因代表11个～20个寡核苷酸[8]。

2 基因芯片在猪重大病毒性疾病检测中的应用

目前,我国猪重大传染病流行的主要特点是多病原混合感染,繁殖障碍性传染病普遍存在,呼吸道传染病日益突出,给我国养猪业造成巨大的经济损失[9]。目前对病毒性传染病的诊断多采用病原分离及常规的血清学方法进行,但病原分离不仅费时费力,而且敏感性和特异性都较差,血清学诊断方法也因实验室条件和诊断方法的不同而产生不同的差异。虽然已有PCR诊断方法应用于病毒检测,但需分别进行诊断。而近年来发展起来的基因芯片技术具有高通量和并行化的特点,可以对成百上千甚至上万个基因进行同时、快速、准确的检测,从而很好地解决了这一问题[10]。基因芯片技术在猪重大病毒性疾病中的应用主要有以下几个方面。

2.1 病毒性疾病检测的低密度基因芯片

迄今,基因芯片检测的敏感性仍不是很高。因此,用基因芯片技术检测病毒性病原体前,须对病原体靶核酸进行扩增。由于同一属内不同病毒或同一类病毒之间的基因组结构相似,通过序列比对,容易找到同源性高的序列,在该区域设计PCR引物,可以用尽量少的引物对扩增尽量多的病毒。而且特异PCR扩增能有效避免细胞成分对检测结果的干扰,提高基因芯片检测的特异性。因此,在猪的几种重大病毒性疾病的研究中利用低密度基因芯片进行病毒性病原体检测的研究较多。

姜永厚等[11]建立的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)基因芯片检测方法,结合了PCR的高灵敏度和核酸杂交高特异性优点,可根据需要在芯片上分区点制多个相同的CSFV阵列以同时特异灵敏地检测多个CSFV样本,利用该方法对87个临床样品进行了检测鉴定,结果分析显示,可准确鉴别CSFV,灵敏度与琼脂糖凝胶检测接近,可检测到的质粒最低浓度为0.4 pg/μ L。曹三杰等[12]采用PCR扩增制备猪传染性胃肠炎病毒(T ransmissible gastroenteritis virus,TGEV)的靶基因并进行纯化,对基因芯片的最佳靶基因点样质量浓度、探针质量浓度、杂交温度、杂交时间进行筛选,选择构建检测芯片的最适靶基因,进行基因芯片探针最佳标记方法试验,从而从各个方面优化了该疾病的基因芯片诊断方法。高淑霞等[13]分别将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudo rabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和CSFV各一段保守序列制备成探针集成到一张芯片上,制备成低密度检测基因芯片,可以同时检测到样品中的6种病毒及病毒核酸的存在情况。张焕容等[14]在前人研究基础之上,制备了PRV、PPV和JEV 3种引起猪繁殖障碍的病毒性传染病检测基因芯片并进行了该基因芯片的检测方法研究,结果表明PRV-PPV-JEV检测基因芯片具有良好的特异性,且该检测系统的灵敏度高达3 pg/μ L。高金拽等[15]将PPV、PCV-2、CSFV分别应用生物信息学方法,针对病毒基因组保守序列设计特异性强的60mer寡核苷酸探针,并将其按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片用于临床诊断,实验结果表明,几种病毒基因的检测探针都能特异性地与相应样品杂交,能检测到较强的阳性荧光信号,而空白对照和阴性对照基本不能检测到荧光信号。Baner M K等[16]报道了区别由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、猪水疱病病毒和水疱性口炎病毒引起的猪在临床上的相同症状的鉴别基因芯片,对代表3个不同病毒的不同来源的39个cDNA样品进行了分析,取得了与PCR鉴定方法完全一致的结果。通过利用基因芯片,为大批量快速诊断、普查猪病毒性疫病提供了保证。

2.2 基因分型中基因芯片的应用

猪病毒存在多样性,不同的病毒型别有着不同的疾病谱、流行特点、地理分布及与其宿主特定的共进化关系等,常见的如FMDV、SIV、PRRSV等。因此,病毒进一步分型对指导防治实践有着极为重要的意义。目前,用于病毒基因分型的方法除了型和亚型特异性PCR之外[17],还有寡核苷酸指纹图谱技术、核酸序列分析法、限制性片段长度多态性分析法、限制性核酸内切酶分析、异源双链泳动法、单链构象多态性、基因组片段长度多态性、核酸杂交法、基因芯片法等。其中基因分型芯片具有灵敏度高,且杂交洗涤后直接扫描,操作简便等突出优点[18]。

Liu Y C等[19]设计的检测PRRSV和FMDV的基因芯片模型。以O型FMDV的VP1结构基因作为一个长信号序列,鉴定了23个不同FMDV株为代表的所有7个血清型。Baner J等[20]设计的一种微阵列芯片,使用的口蹄疫DNA芯片是从正常病毒和特异的血清型基因组VP1-VP3-2A获得的,检测了23个不同的FMDV株代表所有7个血清型并对其进行分型,建立了在单一芯片上进行口蹄疫鉴定和分型的基因芯片技术。

姜永厚等[21]应用寡聚核苷酸基因杂交技术建立了一种快速可靠的检测PCV基因型的方法。他们在PCV保守序列复制酶基因内设计了2对特异性引物,在此物之间设计了2种基因型特异的核苷酸探针(22 mer～30 mer)。通过PCR扩增Cy5标记的DNA片段与固定在玻片表面的探针杂交进行PCV基因分型。该技术很好的结合了PCR方法的高度敏感性和DNA-DNA杂交技术的选择特异性,其检测的结果与Calsamiglia M等[22]相一致。陈红军等人根据流感病毒的HA和NA基因序列间的差异性,采用基因芯片技术,借助多重PCR和核酸标记技术,构建了SIV亚型分型基因芯片,用于SIV亚型的分型,具有检测A型流感病毒和同步鉴别猪流感病毒H1、H3、H9、N1和N2亚型的功能。研究表明,基因芯片用于病毒的基因分型有很多潜在的优势,还有待于进一步的发展。

2.3 表达谱分析中基因芯片的应用

在表达谱分析中,对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与芯片上的基因片段进行杂交,可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断,从而将某个或几个基因与疾病联系起来,确立相关基因功能以及基因与基因间的相互作用关系[23]。目前表达谱基因芯片在兽医学研究领域中已逐步得到应用,并呈现出了其强大的功效,通过检测基因表达水平差异,为阐明不同状况下的基因功能,推断基因与基因的相互关系,揭示基因与疾病的内在联系并发现可能的诊断及药物作用靶基因等方面提供了有力的工具。

袁建琴等[24]已经通过同种组织RNA自身比较试验及不同组织RNA的差异分析试验对CSFV cDNA芯片实验的重复性进行检验,并对cDNA芯片数据的可靠程度,对cDNA芯片试验数据作了整体的评估。结果证实,该芯片系统得到的CSFV cDNA表达谱数据相关系数一般大于0.9,假阳性率控制在2%以内,具有很大的临床参考价值。

3 存在的问题及应用前景

基因芯片技术作为一项新诞生的技术,它也同样有许多问题需要解决。有学者指出基因芯片技术作为一种预测手段还不稳定,应慎重选择[25]。首先该技术需要大量的已测知的、准确的DNA、cDNA片段的信息,充分利用这些信息才能使芯片技术成为大规模、集成化、整体获取生物信息的有效手段,现在尚缺乏公开可得的、经证实准确的基因序列。其次是目前研究芯片技术的费用还比较高昂,尽管芯片或微阵列可以重复多次使用,但每次杂交反应后,其敏感性都要降低。此外,样品制备和标记还比较复杂,各研究机构中仍没有一个统一的质量控制标准,各实验室不能分享数据和资料库等。这些问题已开始为许多研究者所关注。

基因芯片技术作为一种先进的、大规模、高通量检测技术,成为疾病诊断的尖端核心技术之一。其优点表现在:①高度的灵敏性和准确性;②快速简便;③可同时检测多种病原。然而,传统的芯片平台因基于荧光标记技术,应用时需要昂贵的扫描设备以及操作复杂[26],技术要求高,在兽医临床应用中一直难以推广普及。随着功能基因组学和蛋白组学研究的深入和芯片技术的完善,一种易于在基层医疗单位推广使用,能够有效地解决传统基因芯片在应用过程中,需要大型检测设备、不便于推广的瓶颈问题的既经济又可靠的新型基因芯片技术必将诞生,这一新的技术革命一定会在生命科学和相关领域发挥巨大的作用。

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