紫外分光光度法测定硫酸卡那霉素注射液含量方法的建立*

冯学忠,吴广辉,方炳虎,梁德永,黄丽梅

(1.广东大华农动物保健品股份有限公司,广东新兴527400;2.华南农业大学兽医学院,广东广州510642)

硫酸卡那霉素为氨基糖苷类抗生素[1],对大多数革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、变形杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌等有强大抗菌作用,金黄色葡萄球菌和结核杆菌也对其敏感[2]。内服可用于治疗敏感菌所致的肠道感染;肌肉注射用于敏感菌所致的各种严重感染,如败血症、泌尿生殖道感染、呼吸道感染、皮肤和软组织感染等[3]。生产中可用于缓解猪喘气病症状[4]。硫酸卡那霉素注射液的含量测定在《中国兽药典》2005年版一部中采用抗生素微生物检定法[5],由于该法测定费时,不适于作为生产过程中中间产品的质量控制方法。本文采用紫外分光光度法[6]测定硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素的含量[7-13],经与抗生素微生物检定法比较,结果基本一致。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 UV-2450型紫外可见分光光度计,日本岛津产品;CP225D型电子天平,德国赛多利斯有限公司产品。

1.1.2 药品 硫酸卡那霉素标准品,批号为K0080807(效价:每1 mg相当于694卡那霉素单位)购自中国兽医药品监察所;硫酸卡那霉素注射液,规格为10 mL∶1.0 g(100万单位),批号为20091001,20091002,20091003,广东大华农动物保健品股份有限公司产品;硫酸为分析纯;水为纯化水。

1.2 方法

1.2.1 卡那霉素检测波长的确定 精密称取硫酸卡那霉素标准品27.0 mg,置于50 mL容量瓶中,加水溶解,并稀释至刻度,摇匀;精密量取2 mL,置于50 mL容量瓶中,加硫酸10 mL,水浴30 min,冷却,加水离刻度约1 cm,放冷,再加水至刻度,摇匀。用水作为参比液,按照紫外分光光度法,在190 nm～500 nm波长范围内进行图谱扫描。

1.2.2 水解条件的选择 取1.2.1项下配制的溶液2 mL数份,置于50 mL容量瓶中,各加硫酸5 mL、10 mL,分别水浴10、20、30、40、50 min,然后按1.2.1项下操作,测定其吸收度。

1.2.3 绘制标准曲线 精密称取硫酸卡那霉素标准品9.0、18.0、27.0、36.0、45.0 mg,分别置于50 mL容量瓶中,加水使之溶解,并稀释至刻度,摇匀,按1.2.1项下方法稀释成5、10、15、20、25 U/mL标准溶液,以水为参比液,参照紫外分光光度法,在279 nm波长处测定其吸光度。

1.2.4 稳定性试验 精密量取硫酸卡那霉素注射液(批号:20091001)3 mL,置200 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀;精密量取25 mL,置于100 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀;再按1.2.1项下方法稀释至刻度,摇匀,室温避光,静置0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,以水为参比液,按照紫外分光光度法,在279 nm波长处测定吸光度。

1.2.5 空白试验 按处方比例称取辅料适量,制备不含硫酸卡那霉素的空白样品,按1.2.4项下方法稀释并测定吸光度。

1.2.6 回收试验 精密称取卡那霉素对照品18.0、27.0、36.0 mg各3份,分别置50 mL容量瓶中,按处方量加入其他辅料,加溶剂溶解,摇匀,制成小样,分别精密量取2 mL,置50 mL容量瓶中,按1.2.1项下方法稀释至刻度,摇匀,并测定其吸光度。

1.2.7 精密度试验 精密量取硫酸卡那霉素注射液(批号:20091001)3 mL,按1.2.4项下方法稀释至刻度,摇匀;作为测定硫酸卡那霉素注射液精密度试验用溶液,并测定吸光度,重复测定5次,进行精密度测定。

1.2.8 紫外分光光度法与抗生素微生物检定法测定硫酸卡那霉素注射液含量比较

1.2.8.1 紫外分光光度法 取批号为20091001、20091002、20091003的硫酸卡那霉素注射液,精密量取3 mL,分别置于200 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀;精密量取25 mL,置于100 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀;再精密量取2 mL,置50 mL容量瓶中,加硫酸10 mL水浴30 min,冷却,加水离刻度约1 cm,放冷,再加水至刻度,摇匀,按照紫外分光光度法测定;另取硫酸卡那霉素对照品适量,同法测定,并记录结果;计算出含量。

1.2.8.2 抗生素微生物检定法 取批号20091001,20091002,20091003的硫酸卡那霉素注射液,精密量取本品适量,分别用灭菌水定量制成每1 mL中约含1 000单位的溶液,照抗生素微生物检定法测定。1 000卡那霉素单位相当于1 mg的卡那霉素。记录结果,计算出含量。

2 结果

2.1 卡那霉素的检测波长

结果如图1所示。样品在波长279 nm±1 nm处有最大吸收。因此,选择279 nm为检测波长。

图1 卡那霉素紫外吸收图谱Fig.1 The UV map of kanamycin

2.2 水解条件的确定

结果表明,加硫酸10 mL,水浴30 min,卡那霉素与硫酸反应基本稳定,故选择加硫酸量10 mL,水浴30 min为水解条件。

2.3 标准曲线的绘制

标准曲线制作结果如表1所示。以吸光度(A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标进行线性回归,得到标准曲线方程:A=0.037 3 C+0.003 2(R=0.999 6,n=5,C的单位为U/mL)。结果表明,在5 U/mL～25 U/mL的浓度范围内,浓度与吸光度呈良好的线性关系(图2)。

表1 标准溶液的吸光度Table 1 The absorbency of standard solution

图2 卡那霉素标准曲线Fig.2 The standard curve of kanamy cin

2.4 稳定性试验

由表2可见,硫酸卡那霉素注射液在2.5 h内吸光度值基本保持不变,稳定性良好。

表2 硫酸卡那霉素注射液的稳定性试验Table 2 The stability test of kanamycin sulfate injection

2.5 空白试验

结果显示,不含卡那霉素的空白样品无吸收,即辅料对测定结果无干扰,符合要求。

2.6 回收率试验

按下式计算含量,并求出回收率,平均回收率为100.3%,RSD为1.8%,结果如表3所示。

式中:A为测得的吸光度值;N为稀释倍数;V为量取样品的体积(mL);P为样品规格10 mL∶1.0 g(100万单位);0.0032为标准曲线的截距;26.81为标准曲线斜率的倒数。结果表明,硫酸卡那霉素注射液回收率试验符合要求。

2.7 精密度试验

硫酸卡那霉素注射液含量的RSD为0.1%,结果如表4所示。结果表明,本法具有良好的精密度。

表3 硫酸卡那霉素注射液回收率试验Table 3 The recovery rate of kanamy cin sulfate injection

表4 精密度试验Table 4 P recision test of kanamycin sulfate injection

2.8 紫外分光光度法与抗生素微生物检定法测定硫酸卡那霉素注射液含量的比较

结果如表5所示。表明紫外分光光度法与抗生素微生物检定法测得的含量结果基本一致。

表5 硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素的含量测定Table 5 Determination of kanamycin content in injection

3 讨论

本研究表明,用紫外分光光度法和抗生素微生物检定法分别测定硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素的含量,结果基本一致,说明紫外分光光度法可行。卡那霉素的常用测定方法有抗生素微生物检定法、旋光法[14]、高效液相色谱(HPLC)法[15-16]等。抗生素微生物检定法虽然准确,但环境条件要求高,测定周期长,操作复杂,无法达到快速的要求,而且难以区分卡那霉素和其他抗生素药物;旋光法则分辨能力及重现性较差,准确性较低;高效液相色谱法虽然准确,但成本昂贵,操作繁琐,而紫外分光光度法所用仪器较普遍,操作简便、快速,重现性和稳定性良好,结果准确,而且本方法使用的试剂量少,化学反应过程简单,具有一定的优越性。因此,建议兽药生产企业采用紫外分光光度法作为生产硫酸卡那霉素注射液过程中中间产品的质量控制方法。

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