仓鼠源缓慢葡萄球菌的分离鉴定及生物学特性研究

盛相鹏,杜崇涛,许会会,顾敬敏,雷连成,韩文瑜

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062)

缓慢葡萄球菌(Staphylococcus lentus)属于葡萄球菌属(Staphylococcus)。该菌被Kloos等在1976年命名为松鼠葡萄球菌缓慢亚种(Staphylococcus sciuri subsp.lentus)[1],并由Schleifer K H等[2]在1983年将其划分为葡萄球菌属的一个独立的种,即缓慢葡萄球菌(S.lentus)。

缓慢葡萄球菌属于凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative staphylococci,CNS)[1]。CNS曾被认为不具有致病性,但越来越多的资料表明CNS是人类或许多动物不可忽视的致病菌,可引起人类疾病并在医院感染中占据重要地位,尤其对于新生幼儿、存在严重基础疾病或长期接受医院治疗的病人等免疫力低下的人群更容易导致严重的后果[3-7]。由于CNS的多重耐药问题日益严重,CNS引起的感染在国内外呈显著增加的趋势[5,7-9]。有资料表明,缓慢葡萄球菌曾于山羊乳房[1]、水貂的尿道结石及尿液[10]、小鼠的角膜[11]及患病动物的环境中等被分离出来,并被认为可能与动物乳房炎、细菌性角膜炎、医院性感染等有密切的联系[3,6-8,11]。

但至今,国内外对缓慢葡萄球菌的文献报道较少,其感染时机、致病机理及临床意义等尚不清楚[3],被用来进行进一步研究的资料和菌种资源也十分有限。本研究从死亡仓鼠中分离鉴定一株缓慢葡萄球菌,并对其进行了初步研究,以期为进一步探讨该菌特性、临床意义及新发细菌病等提供相关资料和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 来自长春地区某仓鼠养殖场送至本室(微生物与免疫实验室)的一窝(15只)发病死亡的仓鼠。

1.1.2 参考菌株 大肠埃希菌O138、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、大肠埃希菌(ATCC 35218)作为药敏试验质控菌株,均为微生物与免疫实验室保存。

1.1.3 实验动物 18 g～25 g昆明系小鼠,清洁级,5周龄～6周龄左右,购自吉林大学基础医学院动物实验中心。

1.1.4 培养基与试剂盒 LB培养基按常规方法配制(Tryptone,Oxoid LP0042;Yeast Extract,Oxoid LP0021;NaCl)国产分析纯;Mueller-Hinton琼脂培养基MHA为英国Oxoid公司产品;质粒提取试剂盒,凝胶回收试剂盒为爱思进生物技术(杭州)有限公司产品。

1.1.5 主要试剂及药品 氨苄青霉素为Sigma公司产品;限制性核酸内切酶(EcoRⅠ、BamHⅠ),rTaqDNA聚合酶,dNTP Mixture,pMD18-T Simple Vector,均为宝生物工程(大连)有限公司产品;DNA Marker DL 2 000、DNA Marker DL 15 000为天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.1.6 药敏纸片 诺氟沙星(NFX)、氧氟沙星、庆大霉素(GEN)、环丙沙星(CIP)、氨苄西林(AMP)、阿米卡星(AK)、多西环素(DOX),均购自杭州微生物试剂有限公司;克林霉素(DA)、头孢唑林(KZ)、红霉素(E)、头孢吡肟(FEP)、头孢西丁(FOX)、左旋氧氟沙星(LEV)、利奈唑胺(LZD)、青霉素G(P)、利福平(RD/RF)、头孢呋辛(CXM)、复方新诺明(SXT)、头孢噻肟(CTX)、四环素(TE)、替考拉宁(T EC)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、万古霉素(VA),均为英国Oxoid公司产品。

1.1.7 主要仪器 Motic BA400生物显微镜,Motic公司产品,VITEK-2全自动细菌鉴定药敏仪(全自动微生物鉴定/药敏分析系统),法国生物梅里埃公司产品,PCR扩增仪,德国Biometra公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 在无菌超净台内,剖检死亡的仓鼠,采集心脏及血液、肺脏、肝脏、肾脏及脾脏。将所采集的各个内脏涂布普通LB琼脂平板,置于37℃恒温箱培养18 h～24 h。之后无菌挑取LB平板上的可疑菌落染色镜检,并于普通LB液体培养基中进行纯培养。

1.2.2 生化鉴定 按照《VITEK全自动微生物分析系统操作手册》,用灭菌棉签沾取大小为2 mm左右纯培养的菌苔,并移至4.5 g/L NaCl溶液中,稀释成约6.5 Mac单位的细菌悬液;然后将细菌悬液填充VITEK-2 GP鉴定卡、孵育,最后在VITEK-2全自动细菌鉴定仪上读取细菌生化鉴定结果。

1.2.3 致病性试验 将分离菌接种于普通LB液体培养基中,37℃培养8 h后,将培养物倍比稀释并涂布LB琼脂平板,进行平板计数。用无菌生理盐水将培养物进行稀释,使细菌终浓度约为1×109cfu/mL。将10只昆明小鼠平均分成两组(试验组和对照组),每组5只。在试验组中,5只小鼠分别腹腔接种细菌悬液200 μ L(约2×108cfu)/只;对照组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水。观察小鼠的临床症状及活动情况。对死亡小鼠,剖检后进行细菌分离鉴定。

1.2.4 药敏试验 采用Kirby-Bauer琼脂扩散法[12]进行药敏试验。质控菌株为金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、大肠埃希菌(ATCC 35218),抑菌药物药敏纸片质控合格。质控要求、试验方法及判读标准均参照美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)制定的抗菌药物敏感性试验执行标准(2009年版)[13]

1.2.5 PCR鉴定

1.2.5.1 PCR引物设计 在生化试验初步鉴定为缓慢葡萄球菌后,根据GenBank发表的缓慢葡萄球菌的16 S rRNA基因序列(GenBank:FJ795649.1),利用引物设计软件primer 5.0设计一对特异性引物:

预期扩增片段的大小为446 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.5.2 PCR扩增 以分离菌悬液作为模板,进行PCR扩增。50 μ L PCR反应体系为:ddH2O 38.8 μ L,10×PCR buffer(含Mg2+)5 μ L,dNTP Mixture(25mmol/L)4μ L,上游引物(10 pmol/mL)0.5 μ L,下游引物(10 pmol/mL)0.5 μ L,模板1 μ L,rTaq DNA聚合酶(5 U/μ L)0.2 μ L。PCR反应条件为:95℃5 min;94℃45 s,57℃30 s,72℃1 min,共32个循环;72℃延伸10 min。

同时以大肠埃希菌O138作为阴性对照,以ddH2O作为空白对照。PCR产物经12 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5.3 目的片段克隆和基因序列分析 利用凝胶回收试剂盒将目的片段回收纯化并连接到pMD18-T Simple Vector上。连接体系为:SolutionⅠ5 μ L,DNA片段3 μ L,pMD18-T Simple Vector 1 μ L,加ddH2O 1 μ L至终体积为10 μ L。16℃连接18 h后,将连接产物转化DH5α感受态细胞,用Amp琼脂平板进行抗性筛选。利用质粒小提试剂盒提取重组质粒,并经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定重组质粒。鉴定正确的阳性克隆送交北京华大基因研究中心测序,通过NCBI Blast查询GenBank中的同源序列,进行序列同源性分析。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果

从各个死亡小仓鼠的心脏(及血液)、肺脏、肝脏、肾脏和脾脏中均分离出形态一致、数量较多的可疑菌。

2.2 细胞形态学特征

该分离菌为革兰阳性球菌,多为散在,也有成对出现或多个聚集(图1)。

图1 分离菌的镜检形态(10×100)Fig.1 The microscopic morphology of the isolated strain(10×100)

2.3 培养特性

于普通LB琼脂平板上37℃培养24 h,形成圆形、边缘整齐、凸起、光滑湿润、不透明的灰白色菌落,菌落大小为2 mm左右(图2)。该种可疑菌在普通LB液体培养基中生长良好、均匀浑浊,管底有少量黏性沉淀。

图2 分离菌在LB琼脂平板上生长的菌落形态Fig.2 Colonies of the isolated strain on solid medium after 24 h of incubation at 37℃

2.3 生化鉴定结果

VIT EK-2全自动细菌鉴定药敏仪显示该菌为缓慢葡萄球菌。通过仪器读取生化结果,可知该分离菌对大多数糖类碳水化合物反应都呈阳性,也可以分解D-山梨醇、D-甘露醇;该菌对酪氨酸、焦谷氨酸反应呈阳性,而对其他氨基酸反应呈阴性;不分解尿素,磷酸酶试验阳性;对杆菌肽、新生霉素、奥普托欣均耐受。具体生化结果见表1。该菌触酶试验为阳性。

2.4 细菌致病力试验结果

试验组的5只小鼠在腹腔接种分离菌悬浮液(约2×108cfu/只)后的一个星期内没有出现明显病变,在第7天至第15天之间,小鼠逐渐变得沉郁、身体卷缩变形,于第15天至第16天死亡。死亡小鼠消瘦、身体明显畸形,剖检发现内脏形状模糊;从死亡小鼠各个脏器中中分离出缓慢葡萄球菌。而注射生理盐水的对照组小鼠正常,无任何异常症状。

2.5 药敏试验结果

该分离菌对大多数抗生素均十分敏感,但对左旋氧氟沙星(LEV)、环丙沙星(CIP)、诺氟沙星(NFX)、氧氟沙星等氟喹诺酮类药物及复方新诺明(SXT)有很强(或较强)的耐药性(表2)。

表1 分离菌生化试验结果Table 1 The result of biochemical assay of the isolated strain

表2 药敏试验结果T able 2 The result of drug sensitivity test

2.6 PCR鉴定结果

2.6.1 PCR扩增结果 经琼脂糖凝胶电泳检测,分离菌悬液的PCR产物于约446 bp处获得目的条带,片段大小与预期结果相符;而以大肠埃希菌O138、ddH2O作为模板没有得到相应条带(图3)。

图3 PCR产物凝胶电泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis for PCR products

2.6.2 测序结果及序列同源性分析 测序结果显示,插入到载体中的目的片段完全符合预期的大小,为446 bp(其中添加的酶切位点共12 bp,真正属于16 S rRNA基因序列的为434 bp)。NCBI Blast比较结果显示,目的序列测序结果与引物设计参考序列(GenBank:FJ795679.1)及其他缓慢葡萄球菌分离株的16 S rRNA基因序列(GenBank:FJ795683.1、FJ795681.1、FJ795672.1、FJ795671.1、FJ795670.1、FJ795668.1、FJ795656.1、FJ795653.1、FJ795651.1、FJ795649.1(英国爱尔兰),EU794392.1(智利圣地亚哥),EF528296.1(中国黑龙江)等)同源性为100%。由此可以确定该分离菌株为缓慢葡萄球菌。

3 讨论

缓慢葡萄球菌曾被认为是一种以绵羊和山羊为宿主的皮肤及黏膜正常菌群[14],但逐渐增多的资料表明,该菌可能与多种疾病的发生及临床感染密切相关[3,6-8,10-11]。

在本研究中,从所有送检死亡仓鼠的心脏及血液、肺脏、肝脏、肾脏和脾脏中都分离出了缓慢葡萄球菌。由于在发病仓鼠急性死亡后,立即对其进行剖检并进行细菌分离鉴定,故排除了仓鼠死亡后缓慢葡萄球菌入侵的可能。由此可知,仓鼠生前就受到该菌感染,之后该菌大量繁殖引发了菌血症,并经血液循环侵袭到机体的各个内脏器官。而在动物试验中,该缓慢葡萄球菌可以引起试验小鼠的慢性死亡(15 d后才死亡),并出现身体消瘦、畸形等临床症状及造成内脏器官形态模糊。这表明该株缓慢葡萄球菌可能具有致病性。但缓慢葡萄球菌在此次仓鼠急性死亡事件中的具体临床意义尚不清楚,一种可能的推测是该缓慢葡萄球菌引起的菌血症加剧了其他致病菌的感染,从而造成仓鼠的急性死亡。

防治该菌感染的关键在于准确的检测及有效地用药。由于细菌的16S rRNA既含有保守序列,又有中度保守和高度变化的序列区域;保守区序列基本恒定,但可变区序列因细菌种类的不同而发生变化,其中保守区反映了生物物种间的亲缘关系,而可变区则表明物种间的差异[15-16]。随着细菌鉴定研究的深入,16 S rRNA序列分析作为微生物系统分类的主要依据已得到了广泛认同,该技术已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具[17-18]。因此为了准确地检测缓慢葡萄球菌,本试验对缓慢葡萄球菌的16S rRNA基因进行了PCR鉴定及基因同源性比较分析。结果发现该缓慢葡萄球菌与英国、智利、中国黑龙江等地区的缓慢葡萄球菌分离株的16 S rRNA基因同源性达到100%,说明缓慢葡萄球菌虽存在于世界各个地区,但彼此间的基因差异极小。这为通过特异性引物检测缓慢葡萄球菌提供了依据。药敏试验显示,该缓慢葡萄球菌对多种抗生素均十分敏感,但对氟喹诺酮类药物及复方新诺明有很强(或较强)的耐药性。耐药性的产生可能与环境中抗生素的使用有关,因为复方新诺明与氟喹诺酮类药物都是常用的广谱强效抗生素。该缓慢葡萄球菌对复方新诺明及氟喹诺酮类药物的耐药机理可能是由于细菌代谢途径及靶蛋白结构的改变导致药物失效[19]。用庆大霉素等氨基糖苷类抗生素可以很好地治疗该缓慢葡萄球菌引起的感染。

慢葡萄球菌由于与多种疾病密切相关而逐渐引起人们的关注,但至今有关缓慢葡萄球菌的研究甚少。本研究发现缓慢葡萄球菌可以造成仓鼠的全身性菌血症及可以导致试验小鼠的慢性死亡,直接证明了其具有致病性。但缓慢葡萄球菌的致病机理及临床意义仍需进一步研究,这对临床新发细菌病的防治及维护公共卫生安全有着重要的意义。

[1] Kloos W E,Schleifer K H,Smith R F.Characterization of Staphy lococcus sciurisp.nov.and its subspecies[J].Int J Syst Bacteriol,1976,26:22-37.

[2] Schleifer K H,Geyer U,Kilpper-Balz R,et al.Elevation of Staphy lococcus sciuri subsp.lentus(Kloos et al.)to species status:Staphylococcus lentus(Kloos et al.)comb.Nov[J].Syst Appl Microbiol,1983,4:382-387.

[3] Irlinger F.Safety assessment of dairy microorganisms:coagulase-negative staphylococci[J].Int J Food Microbiol,2008,126(3):302-310.

[4] 张秋业,史德功,李晓彦,等.新生儿耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌败血症32例临床分析[J].青岛大学医学院学报,2002,38(1):72-73.

[5] 王向党,金海英,陈红英,等.凝固酶阴性葡萄球菌感染现状分析[J].中华医院感染学杂志,2009,19(14):1919-1920.

[6] Py¨orälä S,Taponena S.Coagulase-negative staphylococci-Emerging mastitis pathogens[J].Vet Microbiol,2009,134(1-2):3-8.

[7] Piette A,Verschraegena G.Role of coagulase-negative staphylococci in human disease[J].Vet Microbiol,2009,134(1-2):45-54.

[8] 廖智香,古力米热.新疆伊犁地区485株葡萄球菌分布及耐药分析[J].医药世界,2006(11):35-36.

[9] 孟华容.临床凝固酶阴性葡萄球菌分布及耐药分析[J].实用医院临床杂志,2005,2(3):94-94.

[10] Schwarz S.Emerging chloramphenicol resistance in Staphylococcus lentusfrom mink following chloramphenicol treatment:characterisation of the resistance genes[J].Vet Microbiol,1994,41(1-2):51-61.

[11] 殷小敏,管怀进,邵义祥.B6-Co小鼠角膜混浊的细菌学研究[J].交通医学,2008,22(6):600-605.

[12] Papadopoulou C,Dimitriou D,Levidiotou S,et al.Bacterial strains isolated from eggs and their resistance to currently used antibiotics:Is there a health hazard for consumers[J].Comp Immunol,Microbiol Infect Dis,1997,20(1):35-40.

[13] CLSI.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;nineteenth informational supplement[S].CLSI document M100-S19.Way ne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2009:47-55.

[14] 陆承平.兽医微生物[M].4版.北京:中国农业出版社,2007:83-84.

[15] 赵玉娟,牛春华,张 雪,等.16 S rRNA序列分析及其在乳酸菌分类、鉴定中的应用[J].食品科学,2009,30(7):299-303.

[16] 周 琳,张 杰.群落分析中的16S rRNA及其基因16S rDNA优化扩增[J].微生物学报,2010,50(1):7-14.

[17] 苑 学,邢 欣,龙 淼,等.牛瘤胃液中链球菌的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医,2009,36(5):45-48.

[18] 周 煜.16 S rRNA序列分析法在医学微生物鉴定中的应用[J].生物技术通讯,1999,10(4):297-305.

[19] 陈杖榴.兽医药理学[M].2版.北京:中国农业出版社,2002:234-239.