针刺、TENS治疗对大鼠深Ⅱ度烧伤的中性粒细胞凋亡的差异性影响

程 洁,朱 毅

(南京中医药大学第二临床医学院,江苏南京 210046)

创伤愈合是一个复杂的生理生化以及分子生物学过程,炎症和免疫反应是创面愈合过程中重要的病理生理变化。烧伤创面早期存在进行损害,使创面加深,防止或减轻创面的早期进行性损害,将有利于创面愈合。已有实验研究[1]显示：针刺有促进烧伤创面的愈合作用,其作用机制可能是多方面的,其中与减轻烧伤创面早期水肿、改善创面微循环、进而减轻创面早期进行性损害有关。经皮电刺激神经疗法(TENS)能改善局部血运,促进水肿吸收,缓解疼痛。

中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)在失控性全身炎症(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)反应中的发生、发展和转归起着关键作用,且凋亡是清除 PMN的非炎症方式,可以有效地避免周围组织损伤[2]。本实验旨在探讨针刺、局部TENS治疗对大鼠中性粒细胞影响及对烧伤 SIRS的干预防治作用。

1 材料与方法

1.1 材料

恒温恒压烫伤仪;Percoll淋巴细胞分离液;Pextran-75000(phaimacia);Annexin V-FITC试剂盒;戊巴比妥钠及流式细胞仪分析。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组与模型制备

清洁级 SD大鼠 40只,体重 230～250 g,由香港理工大学实验动物中心提供,随机分成 4组：针刺组(n=10),TENS组(n=10),烧伤组(n=10),空白组(n=10)。烧伤造模,以 100 ml/l水和氯醛液经腹腔内注射麻醉(30 mg/kg),背部脱毛,次日同法麻醉。用恒温恒压烫伤仪以直径 2.5 cm,90℃,2.3 KPa压力烫伤大鼠背部皮肤 15 s,制成 2.5 cm的深 II度创面 1个(经病理验证)。

1.2.2 治疗

30只经烧伤造模的实验大鼠,予乳酸林格氏液(50 ml/kg)抗休克。针刺组在造模后立即取大鼠双侧“足三里”(李忠仁《实验针灸学》)。常规消毒,针刺后接电针仪,频率 20 Hz,强度 2～4 mA,电压 1～3 V,断续波。强度以保持针刺局部轻微抖动为度,治疗时间30 min。

TENS组在造模后,在烧伤创面四周健康皮肤(距离创面边缘约 0.5 cm)摆放双通道 4个 TENS电极,电流强度 4 mA,治疗时间 30 min。

空白组不做任何处理,大鼠自由饮水,进食。

1.2.3 标本的取材和处理

烧伤组、针刺组、TENS组在建模成功后 24 h心脏取血 5 ml,之后放血处死。取其后肢双侧股骨,用肝素、生理盐水 10 ml冲洗骨髓腔。收集 10 ml于玻璃瓶中反复抽打成单细胞悬液,以常规方式分离周围血中和骨髓中中性粒细胞。以流式细胞仪检测周围血中和骨髓中性粒细胞的凋亡和坏死。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 烧伤造模 24 h后骨髓中性粒细胞的凋亡率

烧伤造模 24 h后骨髓中性粒细胞凋亡率针刺组较 TENS组、烧伤组有明显增加。见表1。各组数据经方差分析总体有显著性差异(P＜0.05),两两比较亦有显著性差异(P＜0.05)。

表1 各组在造模24 h后骨髓 PMN的凋亡率

2.2 烧伤造模 24 h后周围血中中性粒细胞的凋亡率

烧伤造模 24 h后周围血中性粒细胞凋亡率针刺组较 TENS组、烧伤组有明显增加。见表 2。各组数据经方差分析,总体上有显著性差异(P＜0.05);两两比较,TENS组与烧伤组无显著性差异(P＞0.05),针刺组与烧伤组比较、针刺组与 TENS组比较均有显著性差异(P＜0.05)。

表2 各组 24 h后周围血中PMN的凋亡率

3 讨论

烧伤创口愈合是一种病理愈合,在病理情况下伤口愈合延缓,主要是炎症过程和机体免疫功能失调。在伤后愈合的早期表现出机体炎症反应异常或/和免疫功能抑制。

烧伤早期重要的病理变化就是中性粒细胞(PMN)在失控性全身炎症反应(SIRS)中发展预后中起着重要作用。

烧伤后周围血中中性粒细胞增多主要是由于烧伤后边缘池中性粒细胞释放入循环池和骨髓生成释放中性粒细胞增多以及体液丢失血液浓缩所致。张丕红等[3]发现,烧伤早期中性粒细胞凋亡明显减少。这可能是烧伤早期中性粒细胞数目增加的重要机制之一。烧伤后骨髓中中性粒细胞加快释放入血且血浆抑制中性粒细胞凋亡[4],进而使周围血中中性粒细胞数目增加。实验观察针刺可以促进烧伤大鼠周围血中中性粒的凋亡,进而使周围血中中性粒细胞数目相对减少,从而减轻炎症反应以及脏器损害。

总之,中性粒细胞是 SIRS的重要参与者,其凋亡延迟导致了组织损伤。本次实验中,针刺“足三里”既能促进骨髓中性粒细胞的凋亡,减少其释放入血,又能直接促进外周血的中性粒细胞凋亡,从而减轻炎症反应以及脏器损害。这有力证实了针刺这一外治疗法在对于烧伤后全身免疫机制的调节。局部 TENS治疗则能促进外周血中性粒细胞的凋亡,对骨髓中性粒细胞没有显著影响,但在一定程度上也对临床治疗有指导意义。

[1] 谢有富,叶慧贞,梁佩红,等.针刺对深 II度烧伤创面愈合的影响[J].新中医,2000,32(10)：22

[2] 罗志刚,皇子通.中性粒细胞凋亡与多器官功能障碍综合症[J].岭南急诊医学杂志,2007,12(6)：478-479

[3] 张丕红,马恩庆,黄晓元,等.家兔烫伤早期中性粒细胞凋亡变化[J].中华外科杂志,1999,37(12)：771-773

[4] Chitnis D,Dickerson C,Munster AM,el al.Inhibition of apoptosis in polymorphonuclear neutrophils from burn patients[J].J Leukoc Biol,1996,59(6)：835-839