微波辐照诱变选育高产橙色素红曲霉菌

徐 伟，范志诚，刘艳华

(哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076)

微波辐照诱变选育高产橙色素红曲霉菌

徐 伟，范志诚，刘艳华

(哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076)

采用带水循环冷却装置的微波设备，对紫红曲(Monascus purpureus)进行诱变处理，研究微波辐照功率和辐照时间对红曲霉菌的致死规律和突变规律，获得微波功率和时间的最佳辐照剂量，结果表明：在微波功率500W、辐照时间80s时，得到突变株W5S8，液态发酵产橙色素色价为16.38U/mL，较原始菌株橙色素色价10.26U/mL提高了59.62%，连续遗传5代，产色素性状稳定。

红曲霉菌；微波辐照；橙色素；诱变

食品添加剂正朝着天然、安全、高效方向发展，国内外对红曲霉的研究大多集中在发酵生产天然红色素、降胆固醇活性物质等方面[1-3]。红曲的防腐作用早有报道[4-5]，近年来发现，红曲发酵产物中的重要抑菌成分为红曲橙色素，可抑制革兰氏阳性菌以及大肠杆菌，橙色素也有增强免疫力、抗疲劳和降血脂等作用[6-8]。红曲橙色素作为一种具有生理功效的天然色素和抑菌物质，在需要着色和防腐的产品中都可以使用，因而，高产橙色素红曲霉菌的育种工作具有重要的意义。

优良的工业菌种是发酵工业的核心，诱变育种是目前大多数工业微生物育种重要且有效的技术[9]。微波辐照诱变微生物菌种，具有清洁、高效、设备简单等优点，克服了紫外诱变易产生光修复现象的缺点[10-11]。本研究以一株从腐乳中分离的紫红曲(Monascus purpureus)为出发菌株，微波辐照获得高产橙色素的红曲霉突变菌株，为红曲防腐剂的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

紫红曲(Monascus purpureus)从腐乳中分离，经中科院微生物研究所鉴定为紫红曲。

1.2 培养基

固体培养基(g/L)：葡萄糖20、麦芽糖5、蛋白胨10、酵母膏5、琼脂20g，pH值自然；液体发酵培养基(g/L)：大米粉60、黄豆粉5、葡萄糖3、NaNO34、酵母粉5、ZnSO40.2、MgSO41、K2HPO35。

1.3 微波辐照诱变装置

目前进行微波育种的研究人员一般采用普通的家用微波炉设备。在高功率微波辐照条件下，由于微波产生的热效应，会使菌种在短时间内达到很高的热致死

率，微波导致的基因突变性状难以充分显现，为防止诱变过程中菌体温度过高致使孢子大量死亡，本实验采用自行设计的水循环冷却装置[12]保持微波辐照过程中菌悬液温度的低温环境，抵消一部分热效应，实现对出发菌株的低温辐照。

1.4 方法

1.4.1 孢子悬液的制备

菌种斜面在30℃培养7d，用无菌生理盐水将孢子洗涤下来，倒入装有已灭菌玻璃珠的三角瓶中，振荡，将孢子打散，滤去菌丝体，制得孢子悬浮液，并调整孢子浓度至105个/mL。

1.4.2 微波辐照诱变方法

将已制备的浓度为105个/mL孢子悬液10mL移入无菌试管内，并将该试管置于带冷却循环水的微波装置中，在时间为90s时，分别以100～800W(间隔100W)功率进行辐照处理，辐照功率为500W时，分别以10～150s(间隔10s)时间进行辐照处理。对辐照后孢子悬液进行倍比稀释，涂布于平板固体培养基上，于30℃恒温培养3d，记录总菌落数和存活菌落数，计算致死率和突变率，确定最佳诱变条件。

1.4.3 菌株筛选

初筛：辐照后孢子悬液于30℃恒温平板培养，7～10d后观察菌落形态差异，选取形态和颜色变化较大的菌落，用无菌水洗涤孢子，分别制得孢子悬液，进行复筛备用。

复筛：分别将初筛到的红曲霉菌孢子悬液吸取10mL，接种于150mL液态发酵培养基中，在培养温度30℃、摇床转速200r/min条件下培养14d，测定红曲橙色素色价，挑选橙色素产量高的菌株进行培养。

1.4.4 突变株的遗传稳定性实验

将复筛得到的橙色素高产突变株连续传代5次，分别于培养温度30℃，摇床转速180r/min条件下在液体发酵培养基中培养14d，并测各代菌株所产橙色素色价。

1.4.5 橙色素色价测定[13]

吸取发酵液1mL加入装有75%乙醇溶液9mL的试管中，加塞、摇匀，静置20min后，用快速滤纸过滤得清液，再适当稀释，用75%乙醇溶液作空白对照，用紫外分光光度计在橙色素最大吸收波长465nm处测定OD值，将OD值乘以稀释倍数，即为橙色素色价。橙色素色价计算公式如下：

橙色素色价/(U/mL)=OD465nm×稀释倍数

2 结果与分析

2.1 微波辐照功率和辐照时间对红曲霉菌致死率的影响

考察辐照时间90s时，微波功率不同辐照剂量对红曲霉的致死规律，同时进行微波功率为500W，不同辐照时间的红曲霉菌致死率实验。对辐照后菌悬液进行梯度稀释，选取稀释度10-3、10-4菌悬液涂布平板上，各稀释度做3个平行样，在温度30℃培养 3d，进行菌落计数，计算致死率，结果如图1所示。

图1 微波功率和辐照时间与致死率的关系Fig.1 Correlation of microwave power and irradiation duration with lethal rate ofMonascus purpureus

由图1可知，微波辐照时间不变，致死率随微波辐照功率提高而增大；在微波功率不变时，致死率随着微波辐照时间延长而增大。据资料显示[14]，红曲霉菌在致死率为60%～90%时，菌株突变率大，本实验得到微波辐照90s，功率300～600W时，致死率恰好在60%～90%之间；微波功率为500W，辐照时间60～90s时，致死率也在60%～90%之间，因此，选择辐照功率范围为300～600W时，辐照时间在60～90s时，进行橙色素突变菌株的研究。

2.2 微波辐照剂量对红曲霉菌橙色素产量的影响

2.2.1 微波辐照功率对红曲霉菌橙色素产量的影响

时间为90s时，对微波功率300、400、500、600W的4个剂量组辐照后的孢子悬液进行平板培养，分别挑取15株菌进行摇瓶发酵实验，测定橙色素色价，结果如图2～5 所示，其中0号菌株为原始菌株。

图2 300W微波辐照90s菌株产橙色素色价Fig.2 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 300 W and irradiation duration of 90 s

图3 400W微波辐照90s菌株产橙色素色价Fig.3 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 400 W and irradiation duration of 90 s

图4 500W微波辐照90s菌株产橙色素色价Fig.4 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 500 W and irradiation duration of 90 s

图5 600W微波辐照90s菌株产橙色素色价Fig.5 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 600 W and irradiation duration of 90 s

本实验考虑检测误差，限定产橙色素色价超过原始菌株5%以上为正突变、±5%以内为未突变、-5%以下为负突变，与原始菌株比较，计算各段内菌株的百分数，结果如表1所示。

由表1可知，在辐照时间90s条件下，正突变率随微波辐照功率增大而先增大后减小，在功率为500W时，正突变率最高为47%，得到橙色素色价为16.05U/ mL的突变株W5S9，该菌株比未照射组提高了56.43%。300W时得突变株W3S9，产橙色素色价为13.29U/mL，提高了29.53%；400W时得突变株W4S9，产橙色素色价为14.63U/mL，提高了42.59%；600W时得突变株W6S9，产橙色素色价为15.81U/mL，提高了54.09%。

表1 微波时间90s时不同辐照功率的红曲霉菌株突变比例Table 1 Mutation rate ofMonascus purpureusunder different microwave powers and irradiation duration of 90 s

2.2.2 微波辐照时间对红曲霉菌橙色素产量的影响

图6 500W微波辐照60s菌株产橙色素色价Fig.6 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 500 W and irradiation duration of 60 s

图7 500W微波辐照70s菌株产橙色素色价Fig.7 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 500 W and irradiation duration of 70 s

图8 500W微波辐照80s菌株产橙色素色价Fig.8 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 500 W and irradiation duration of 80 s

功率为500W时，对辐照时间60、70、80、90s的4个剂量组辐照后的孢子悬液进行平板培养，分别挑取15株菌，进行摇瓶发酵实验，测定橙色素色价，结果如图4、图6～8 及表2所示，其中0号菌株为原始菌株

表2 微波功率500W不同辐照时间时红曲霉突变菌株比例Table 2 Mutation rate ofMonascus purpureusunder different microwave irradiation duration and microwave power of 500 W

由表2可知，正突变率随微波辐照时延长间而先增大后减小，其中微波辐照500W，辐照时间为80s时正突变率最高为53%，可得突变株W5S8，产橙色素色价为16.38U/mL，比未照射组提高了59.62%。功率500W辐照时间60s时，得突变株W5S6，产橙色素色价为15.02U/mL，比未照射组提高了46.39%；辐照时间70s时，得突变株W5S7，产橙色素色价为15.93U/mL，比未照射组提高了55.26%。

2.3 微波辐照突变株的稳定性

通过对原始菌株与辐照后菌株的菌落形态观察对比发现，突变菌株的菌落形态和颜色、孢子大小、菌丝粗细均有不同程度变化。突变株W5S8较原始株菌落直径变大，菌落颜色加深，气生菌丝也更加浓密，将红曲霉突变株W5S8接种于斜面培养基，连续传代5次，进行液态发酵，测定橙色素色价。其橙色素色价分别为16.38、16.34、16.42、16.39、16.41U/mL，说明产橙色素遗传稳定性较好。

3 讨 论

采用水循环冷却装置的微波设备，克服了在高功率辐照时，短时间内热致死率高、基因突变率低的问题。通过考察微波辐照功率和时间对红曲霉菌株突变率的影响，可知，正突变率随微波辐照剂量增大而增大，但超过一定剂量，正突变率下降。微波是一种电磁波，能引起水、蛋白质、核苷酸、脂肪和碳水化合物等极性分子转动，尤其是水分子在2450MHz微波作用下，能在1s内180°来回转动24.5×108次，从而，引起分子间强烈的摩擦，使得菌体细胞内DNA分子氢键和碱基堆集化学力受损，最终引起DNA分子结构发生变化，导致遗传变异。

微生物在未接受到足够损伤造成突变的照射之前，由于蛋白质、酶的活性都会不断地变化，在某一范围内，恰好使细胞内合成蛋白质或酶的活性达到最大，此时，就大大地提高了孢子分裂增殖速度。当然强度过大，也会导致蛋白质变性、酶失活、孢子死亡、致死率增大[15]。在微波辐照功率500W、辐照时间80s条件下，红曲霉产橙色素色价正突变率高。因此，微波诱变应用于红曲霉菌株选育简便、有效，为红曲橙色素在食品防腐抑菌中应用提供了技术支持。

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Mutation Breeding of Monascus purpureus with High Productivity of Orange Pigments by Microwave Irradiation

XU Wei，FAN Zhi-cheng，LIU Yan-hua
(College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Microwave irradiation with water-cooling device was used for the mutagenesis of Monascus purpureus. The optimal microwave power, irradiation duration and dosage for the mutagenesis of Monascus purpureus were explored by evaluating the lethal and mutation regularity of Monascus purpureus. Results indicated that the optimal mutation conditions were microwave power of 500 W and irradiation duration of 80 s. Under the optimal microwave irradiation conditions, a mutated strain W5S8 with the highest productivity of orange pigments was achieved and the color value of orange pigments from strain W5S8 was 16.38 U/mL, which was increased by 59.62% compared with the parent strain. Its productivity for orange pigments remained stable after subculture for 5 generations or storage.

Monascus purpureus；microwave irradiation；orange pigment；mutation

TS202.3

A

1002-6630(2010)23-0224-04

2010-09-20

黑龙江省科技厅重大科技攻关项目(GA07B401-3)

徐伟(1963—)，女，副教授，博士，研究方向为发酵工程。E-mail：xuwei20070808@yahoo.com.cn