高效液相色谱法测定家兔血浆中苦参碱的浓度

刘卫平，李艳辉

（长沙医学院药学系，湖南长沙410219）

苦参碱系从豆科槐属植物苦参、山豆根和苦豆子中提取、分离、纯化制得的生物碱，具有抗病毒、抗肝纤维化、升高白细胞、增强免疫力等药理作用和功效，临床主要用于治疗病毒性肝炎[1,2]。本实验采用HPLC法测定家兔血浆中苦参碱浓度，方法简便准确，重现性好，可用于苦参碱纳米粒家兔体内的药动学研究，并为苦参碱纳米粒的体内分布试验提供参考。

1 仪器与材料

LC－10ATVP－ODS型高效液相色谱仪，包括SPD－10AVP紫外检测器 (日本岛津)；LDZ4-0.8自动平衡离心机 (北京医用离心机厂)；XW-80A漩涡混合器 (上海精科实业有限公司)。苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号10256-0203)；苦参碱原药(宁夏紫荆花药业公司盐池药厂，含量98.2%，批号6010829)；甲醇为色谱纯，乙醚等为分析纯。家兔(2～3kg，长沙医学院动物中心提供)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：AICHROM-SiO2柱 (4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-三乙胺(每100mL甲醇加3μL三乙胺)；检测波长：220nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取苦参碱对照品25mg，置于10mL量瓶中，加甲醇10mL溶解并定容至刻度，即得2.5mg/mL的苦参碱对照品储备溶液。4℃冷藏备用。使用时用甲醇稀释至所需浓度。

2.3 血浆处理方法

精密吸取家兔含药血浆样品1.0mL，置10mL离心管中，加蒸馏水1.0mL，20%氢氧化钠溶液0.5mL，混匀加入乙醚3mL，漩涡30s，离心5min (4000r/min)，分取乙醚层于试管中，45℃水浴中氮气吹干，将残留物准确用100μL甲醇溶解，取20μL进样。

2.4 方法专属性

在选定的色谱条件下，血浆中内源性杂质对测定无干扰，苦参碱峰形良好，分离完全，其保留时间为4.5min。色谱图见图1。

2.5 线性关系考察

取离心管数支，分别加20 μL苦参碱系列浓度对照品溶液，氮气吹干，再加入1mL空白血浆，配制成终质量浓度为 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、20、50μg/mL的血浆样品。按"2.3"项处理血浆样品，进样20 μL，测定样品中苦参碱峰面积，以峰面积A对血浆浓度C进行线性回归，得回归方程为：A＝36828C+6816.4，r＝0.9998。结果表明，苦参碱血浆质量浓度在0.1～50μg/mL范围内线性关系良好。定量下限为0.1μg/mL。

2.6 精密度与回收率试验

取离心管数支，分别加20 μL苦参碱对照品系列溶液，氮气吹干，再加入1mL空白血浆，配制成终质量浓度为0.2、1.0、50μg/mL的血浆样品。按" 2.3"项处理血浆样品，进样20 μL。同一天内每个浓度平行配制5份，计算日内精密度和回收率。连续3d内每个浓度各平行配制5份，计算日间精密度。结果见表1。

表1 精密度试验和回收率试验结果(n=5)

2.7 样品稳定性试验

取离心管数支，分别加20 μL苦参碱对照品系列溶液，氮气吹干，再加入1mL空白血浆，配制成终质量浓度为0.2、1.0、50μg/mL的血浆样品，分别于配制当天室温放置6h、-20℃下反复冻融和冷冻20d，按"2.3"项处理血浆样品，进样20 μL，测定，以考察样品在不同条件下的稳定性。结果见表2。

表1 精密度试验和回收率试验结果(n=5)

3 讨论

苦参碱的含量测定方法有多种，文献报道主要有HPLC法、薄层扫描法、酸性染料比色法和高效毛细管电泳法等[3-6]。其中HPLC法测定时文献报道有用C18柱[7]和氨基键合柱[3]，本研究采用AICHROMSiO2柱，甲醇为流动相，在流动相中加入三乙胺，峰形明显改善，且分离度也较满意。

苦参碱为一弱碱性药物，在碱性条件下采用有机溶剂提取。文献报道有用氯仿-正丁醇混合溶剂提取[8]，本实验采用乙醚提取也得到了理想的结果。

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