HSP60及 TLR4信号途径在小鼠心脏移植物中的表达及意义＊

陈家军, 吴宏妍, 孙宗全, 聂荣华, 吴富常, 张增旺

(1襄樊市中心医院心胸外科,湖北襄樊 441021;2华中科技大学同济医学院附属协和医院心外科,湖北武汉 430022)

移植排斥反应是制约心脏移植远期效果的重要因素,其机制目前尚未完全阐明。近来很多证据显示 Toll样受体 4(Toll-like receptor,TLR4)信号途径在启动移植排斥反应中起着关键性的桥梁作用[1],热休克蛋白 60(heat shock protein,HSP60)作为内外源性配体与 TLR4等分子结合,可能通过调控单核/巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞的活化、分化群 80(cluster of differentiation 80,CD80)等第二信号的表达,在移植免疫中发挥重要作用[2,3]。为了解 HSP60及 TLR4信号途径心脏移植排斥反应中的作用及可能机制,我们对小鼠心脏移植物HSP60、TLR4及其下游分子髓样分化因子 88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、核因子 -κB (NF-κB)的表达情况进行了研究。

材 料 和 方 法

1 材料

抗小鼠HSP60、MyD88及NF-κB抗体购于Lab vision,抗小鼠 TLR4抗体购于 Abcam,辣根过氧化物酶偶联羊抗兔 IgG抗体及羊抗小鼠 IgG抗体购于北京中山生物技术有限公司,ECL增强型化学发光显色试剂盒为 Pierce产品,细胞因子 EL ISA试剂盒购于晶美公司,其它试剂均为进口或国产分析纯。

2 动物分组与模型

健康雄性BALB/c小鼠 12只和 C57BL/6小鼠36只,体重 20-25 g,2-3个月龄,由华中科技大学同济医学院器官移植研究所提供。随机分为 2组: (1)对照组(同系移植组):供、受体各 12只,供、受体均为 C57BL/6小鼠;(2)实验组 (同种异品系移植组):供、受体各 12只,供、受体分别为 BALB/c、C57BL/6小鼠。采用袖套管技术制作小鼠颈部心脏移植模型,自制内径分别为0.4 mm和0.6 mm的动、静脉套管,利用套管将受者颈总动脉与供心主动脉吻合,受者颈外静脉与供心肺动脉吻合,术后每天触诊观察移植心存活时间。

3 免疫组化检测心脏移植物 HSP60、TLR4、M yD88及NF-κB表达的变化

移植后第 3 d、第 7 d取小鼠心脏移植物,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片。然后脱蜡、水化,3% H2O2室温封闭 5-10 min,羊血清封闭液室温封闭 30 min。滴加各种Ⅰ抗,4℃湿盒过夜,PBS清洗后滴加1∶100辣根酶HRP标记山羊抗兔 IgGⅡ抗,室温孵育30 min,PBS清洗后滴加辣根过氧化物酶,DAB显微镜下控制显色,苏木素复染。显微镜观察、摄像。

4 W estern blott ing检测心脏移植物 HSP60、TLR4、M yD88及 NF-κB的表达

移植后第 3 d、第 7 d取小鼠心脏移植物,参照《分子克隆》的实验方法,包括蛋白提取、电泳、转印、杂交及显色,X光片曝光显影,凝胶成像分析系统摄像分析。

5 病理分析及排斥反应分级

移植后第 3 d、第 7 d取小鼠心脏移植物,做病理切片,苏木精 -伊红(HE)染色,光镜观察,并对病理组织排斥反应等级评分,分级标准[4]:0级:无排斥反应表现;1级:少量而散在的单核细胞浸润或轻度的心肌细胞变性;2级:中度的单核细胞浸润或片状心肌细胞变性;3级:中、重度单核细胞浸润与明显的心肌细胞变性和/或灶状坏死;4级:重度单核细胞浸润与大片心肌细胞变性、坏死,间质可有出血。

6 酶联免疫法(EL ISA)检测受体小鼠血 TNF-α、I L-12及 IFN-γ的浓度

分别于移植后第 3 d、第 7 d取小鼠血清,按EL ISA试剂盒说明操作,每组设 3复孔,检测 TNF-α、IFN-γ和 IL-12的含量。

7 统计学处理

采用 SPSS 13.0软件包分析,数据以均数 ±标准差(±s)表示,采用独立样本 t检验。

结 果

1 免疫组化检测心脏移植物 HSP60、TLR4、M yD88及NF-κB的变化

对照组移植术后 3 d、7 d移植心脏局部 HSP60、TLR4、MyD88及NF-κB均呈阴性或弱阳性表达,而实验组均呈强阳性表达,HSP60、MyD88及NF-κB 7 d时的表达均强于 3 d时,而 TLR4 3 d时的表达强于 7 d时。HSP60的表达主要位于心肌细胞胞浆及浸润的炎性细胞;TLR4的表达主要分布于心肌细胞,血管内皮细胞及血管周围、心肌间浸润的单核细胞;MyD88主要表达于心肌细胞胞浆;NF-κB主要表达于心肌细胞及血管周围、心肌间浸润的单核细胞,见图 1-4。

2 W estern blotting检测心脏移植物 HSP60、TLR4、M yD88及 NF-κB的表达

对照组移植术后 3 d、7 d移植心脏局部 HSP60、TLR4、MyD88及NF-κB的表达均较低;实验组移植术后7 d时HSP60、MyD88及NF-κB的表达明显高于移植术后 3 d,TLR4 3 d时的表达强于 7 d时。与对照组相比,各时点 HSP60、MyD88及NF-κB的表达均增强,差异显著 (P＜0.05),见图 5。

3 心脏移植物病理形态分析

对照组移植术后 3 d、7 d均未见明显移植排斥反应;实验组移植术后 3 d排斥反应的病理分级为 2 -3级,7 d时为 4级,见图 6。

Figure 1. Expression of HSP60 in immunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control(isograft)group;B:experimental(allograft)group.图 1 免疫组化显示 HSP60在 2组心脏移植物中的表达变化

Figure 2. Expression of TLR4 inimmunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control group;B:experimental group.图 2 免疫组化显示 TLR4在 2组心脏移植物中的表达变化

Figure 3. Expression of MyD88 in immunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control group;B:exper imental group.图 3 免疫组化显示M yD88在 2组心脏移植物中的表达变化

Figure 4. Expression of NF-κB in immunohistochemicallystained cardiac allograft from two groups(SP,×200). A:control group;B:experimental group.图4 免疫组化显示 NF-κB在2组心脏移植物中的表达变化

4 心脏移植后外周血 TNF-α、I L-12及 IFN-γ的变化

对照组移植术后 3 d、7 d外周血 TNF-α、 IL-12及 IFN-γ的浓度未见明显变化;与对照组相比,实验组各时点外周血 TNF-α、 IL-12及 IFN-γ的浓度明显升高,且 7 d较 3 d时的浓度显著升高,差异显著(P＜0.01),见图 7。

Figure 5.Expression of HSP60,TLR4,MyD88 and NF-κB in cardiac transplantation from two groups by Western blotting.±s.n=6.★P＜0.05vscontrol group,▲P＜0.05vsexperimental group at 3d after heart transplantation.图 5 W estern blott ing检测 HSP60、TLR4、M yD88及 NF-κB蛋白在 2组心脏移植物不同时点的表达变化

讨 论

最近研究认为,Toll样受体 (TLRs)及其信号途径是衔接先天性免疫和获得性免疫的桥梁,在移植免疫中扮演重要角色[5]。TLR4所识别的病原相关分子模式配体包括外源性微生物分子,以及细胞膜破损和应激释放的内源性物质。心脏移植手术创伤、缺血再灌注及应激损伤均可使细胞释放抗原性很强的 HSP60,并通过 TLR4以MyD88依赖的途径活化单核巨噬细胞及血管内皮细胞等多种细胞[6],激活NF-κB,活化相关免疫基因,上调前炎性细胞因子、CD80、CD86等共刺激分子和化学趋化因子表达,促使DC等抗原提呈细胞成熟,诱导产生效应细胞和细胞因子,引起急慢性排斥反应[7]。

本研究显示,实验组各时点 HSP60的表达均强于对照组,同时伴有 TLR4、MyD88及NF-κB的表达增高,且实验组心脏移植物出现明显排斥反应,说明 HSP60作为内源性抗原物质参与了移植排斥反应。正常条件下,HSP60以稳定状态存在于细胞质和线粒体基质中,应激时 HSP60迅速从胞质中转移到线粒体基质以修复线粒体基质中的变性蛋白[8],保护细胞免受应激伤害作用,提高细胞的“应急耐受”能力,而当心脏移植后 HSP60释放至细胞外时,则作为同种异体抗原激活炎性反应[9]。关于 HSP60参与排斥反应的详细机制有待进一步研究。

Figure 6.Cardiac transplantswere stainedwith HE formorphological evaluation in two groups at7 d after transplantation(HE staining, ×200).A:control group;B:experimental group.图 6 HE染色及 2组心脏移植物 7 d时病理组织学变化

Figure 7.Expression of TNF-α,IFN-γand IL-12 in peripheral blood from two groups by EL ISA.A:expression of TNF-αin two groups;B:expression of IFN-γ in two groups;C:expression of IL-12 in two groups. ±s.n=6.＊＊P＜0.01vscontrol group;▲▲P＜0.01vsexperimental group(3 d).图 7 心脏移植后 2组外周血中 TNF-α、IFN-γ及 I L-12浓度比较

本实验中,实验组各时点 TLR4、MyD88及NF-κB的表达均强于对照组,且 7d时MyD88及NF-κB的表达明显高于移植术后 3d,说明在心脏移植排斥反应中存在 TLR4信号途径的激活。有证据显示细胞因子参与了移植排斥反应[10],本实验结果亦表明,实验组各时点外周血中 TNF-α、 IL-12及 IFN -γ的浓度明显升高,实验组 7d时细胞因子的浓度明显高于 3d,且与排斥反应的病理分级变化一致,表明上述细胞因子与心脏移植排斥反应的发生发展密切相关。TNF-α、 IL-12及 IFN-γ均为 Th1型细胞因子,其中 IL-12最为重要,主要由抗原提呈细胞,如单核巨噬细胞及DC产生,少部分由B淋巴细胞产生[11]。 IL-12作为一种多功能细胞因子,在移植排斥反应中具有独特的生物学作用[12,13]:促进 T细胞及自然杀伤(NK)细胞增殖;诱导细胞毒性 T细胞成熟并增强其细胞毒作用;诱导静止及活化NK细胞及 T细胞产生 IFN-γ;诱导其它细胞产生 TNF-α、IL-2、 IL-3等 Th1型细胞因子产生,促进 Th1细胞发育,同时抑制 Th2细胞发育。

单核/巨噬细胞的激活、内皮细胞的损伤及中性粒细胞的浸润是移植排斥发生的重要机制,细胞间及细胞与细胞因子间的作用是其发生的基础。本实验中,免疫组化提示 HSP60、TLR4、MyD88及 NF-κB多分布于心肌细胞、血管内皮细胞及血管周围、心肌间浸润的单核细胞 (图 1-4),由此我们可以推测,心脏移植后释放 HSP60及其它多种内源性物质,经抗原提呈细胞提呈给 T细胞,以MyD88依赖的方式激活 T细胞增殖,同时心肌细胞间及血管内的粒单核细胞等细胞表面的 TLR4被激活,促进单核细胞、巨噬细胞及DC释放 TNF-α、 IL-12及 IFN-γ等炎性介质,导致早期炎症因子的瀑链式反应,促进排斥反应,但其详细机制有待进一步证实。Western blotting显示实验组 7 d时 TLR4的表达弱于 3 d时,与MyD88及NF-κB的变化不一致,可能的原因为,心脏移植后在大量内外源性抗原刺激下,机体启动了负反馈调节的保护机制,通过内吞作用,将 TLR4配体受体复合物转移到溶酶体中降解,即受体下行调节,清除有害的炎症因子,减轻其对机体的损害[14]。

本研究结果表明,心脏移植后释放的内源性配体 HSP60可能激活 TLR4信号途径引起排斥反应,提示 HSP60在移植排斥反应中可能具有重要作用,调控其受体后信号途径可能为抗排斥反应提供新思路。

[1] SamsteinB,Johnson GB,PlattJL.Toll-like receptor-4 and allograft responses[J].Transplantation,2004,77 (3):475-477.

[2] 吴 伟,李大主,周 游,等.负载HSP60树突状细胞对小鼠动脉粥样斑块影响研究[J].中国病理生理杂志,2007,23(3):208-211.

[3] Goldstein DR,Tesar BM,Akira S,et al.Critical role of the Toll-like receptor signal adaptor proteinMyD88 in acute allograft rejection [J]. Clin Invest,2003,111 (10):1571-1578.

[4] Billingham ME.Diagnosis of cardiac rejection by endomyocardiac biopsy[J].Heart Transplant,1981,1(2):25 -30.

[5] Land WG.Innate immunity-mediated allograft rejection and strategies to prevent it[J].Transplant Proc,2007, 39(3):667-672.

[6] Bulut Y,Faure E,Thomas L,et al.Chlamydial heat shock protein 60 activates macrophages and endothelial cells through Toll-like receptor 4 and MD2 in a MyD88 -dependent pathway[J]. Immunol,2002,168(3): 1435-1440.

[7] Akira S,Takeda K,Kaisho T.Toll-like receptors:critical proteins linking innate and acquired immunity[J]. Nat Immunol,2001,2(8):675-680.

[8] Itoh H,Komatsuda A,Ohtani H,et al.Mammalian HSP60 is quickly sorted into themitochondria under conditions of dehydration[J]. Eur J Biochem,2002,269 (23):5931-5938.

[9] Lehnardt S,Schott E,Trimbuch T,et al.A vicious cycle involving release of heat shock protein 60 from injured cells and activation of toll-like receptor4 mediates neurodegeneration in the CNS[J].J Neurosci,2008,28 (10):2320-2331.

[10]Agnello D,Trinchieri G,Pflanz S,et al.The IL-12 family of heterod imeric cytokines:new players in the regulation of T cell responses[J]. Immunity,2003,19(5): 641-644.

[11] Youssef AR,Otley C,Mathieson PW,et al.Effector mechanis ms in murine allograft rejection and comparison of skin and heart grafts in fully allogeneic andminor histocompatibility antigenmismatched strain combinations[J]. Transpl Int,2002,15(6):302-309

[12]Ver ma N,He XY,Chen J,et al. Interleukin 12 delays allograft rejection:Effect mediated via nitric oxide[J]. Transplant Proc,2001,33(1-2):416-417.

[13]Wang H,DeVriesME,Deng S,et al.The axis of interleukin 12 and gamma interferon regulates acute vascular xenogeneic rejection[J].NatMed,2000,6(5):549-555.

[14]Dybdahl B,Wahba A,Lien E,et al. Inflammatory response after open heart surgery:release of heat-shock protein 70 and signaling through Toll-like receptor 4 [J].Circulation,2002,105(6):685-690.