脐带血 CD4+和 CD8+T细胞中 T细胞特异转录因子 Elf-1表达特点＊

林春兰, 陈少华, 杨力建, 郑海涛, 沈 琦, 周羽竝, 李扬秋,3

(暨南大学医学院1生物化学教研室,2血液病研究所,3再生医学教育部门重点实验室,广东广州 510632)

脐带血 (umbilical cord blood,UCB)作为异基因造血干细胞移植物,由于其具有容易获取、来源丰富、方便快捷、移植物抗宿主病 (graft versus host disease,GVHD)的发生率和严重程度低、潜伏性病毒传播的机率低等优点,使UCB作为一种新的重要的造血干细胞,尤其是无血缘关系造血干细胞的供体显示出广阔的应用前景。目前,UCB移植不仅仅被应用于血液病、自身免疫性疾病、免疫缺陷和代谢性疾病以及遗传性疾病等多种疾病的治疗,还开始应用于神经系统疾病、心脏疾病、缺血性下肢血管病、实体瘤的治疗以及组织再生医学方面的应用研究,尽管有些还处于实验阶段,但充分说明了 UCB的重要作用得到了普遍的肯定[1,2]。有关 UCB T细胞的免疫学特性目前研究不多,本课题组前期研究了 UCB T细胞的 T细胞受体(T cell receptor,TCR)Vα和Vβ基因谱系分布特点[3,4]及 TCRζ链基因的表达特点[5],本研究拟在此基础上进一步了解 TCRζ基因特异性转录因子 Elf-1(E74-like factor 1)在 UCB单核细胞细胞及其 CD4+和 CD8+T细胞亚群中的表达特点,以期为更有效、更合理地应用 UCB提供一些实验依据。

材 料 和 方 法

1 标本收集

收集健康妇女妊娠 38-40周之间正常分娩时脐带血 12例(标本来源于广州暨南大学附属第一医院),产妇无恶性肿瘤和各种遗传性疾病,无急慢性传染病。按常规方法分离单个核细胞,再利用 CD4和 CD8磁珠单抗(MiltenYibiotec)和免疫磁珠分选法(MCAS)分选 CD4+和 CD8+T细胞,10例健康成人外周血样本作为对照。

2 RNA提取及 cDNA合成

按常规方法用 Trizol试剂盒 (Invitrogen)提取RNA,随机引物和反转录酶试剂盒 (PowerScriptTMReverse,BD)反转录合成 cDNA第 1链;用 RT-PCR检测β2微球蛋白 (β2-microglobulin,β2M)基因的表达情况以检验所合成 cDNA的质量。

3 引物设计

Elf-1:上游引物 5′-ACAAAGATGGAAAGGGAAACA-3′,下游引物 5′-CCACAACCTGGACACTGCT-3′(基因序列号为 001145353),扩增目的片段长度 152 bp,引物由上海英骏合成。β2M:上游引物 5′-TACACTGAATTCACCCCCAC-3′,下游引物5′-CATCCAATCCAAATGCGGCA-3′,产物片段大小为 144 bp,引物由德国柏林 T IB Molbiol公司合成。

4 扩增效率一致性检测

检测样本 Elf-1基因表达情况之前,根据相对定量法分析的原则,首先必须保证 Elf-1和β2M mRNA的扩增效率的一致。故将Molt-3细胞株的cDNA以 5倍倍比稀释,以 50-5-4作为模板,进行SYBR GreenⅠ实时定量 PCR来检测其扩增效率是否一致。

5 SYBR GreenⅠ实时定量 PCR

利用 SYBR GreenⅠ荧光定量 PCR检测各样本Elf-1 mRNA表达情况,并将β2M mRNA作为内参照。每一标本分别进行 Elf-1和β2M检测。总反应体积为 20μL,应用 RealMasterMix试剂盒 (Tiangen),包括 2.5×RealMasterMix 9μL、0.5 mmol/L上、下游引物以及 1μL cDNA。在 95℃、2 min变性后,共进行45个循环扩增,每一循环包括 95℃20 s, 62℃40 s。并在 79℃和 81℃2次读板 (1 s)。随后,以 0.17℃/s变化速度从 55℃到 95℃每隔 2 s记录 1次荧光值,获得熔解曲线。反应在 Chromo 4荧光定量 PCR仪 (Bio-Rad)中进行。每样本均重复2次检测。

6 Elf-1 mRNA相对表达水平的计算

采用相对定量法分别分析脐带血和健康成人外周血 Elf-1 mRNA的表达水平,以β2M为内参照,利用△Ct值,计算脐带血和健康成人外周血 Elf-1 mRNA相对表达量,计算公式为[6]:mRNA相对表达量 =2-△Ct×100%,其中,△Ct=Ct(Elf-1)-Ct(β2M)。

7 统计学处理

采用 SPSS 11.5软件分析。计量资料数据以均数 ±标准差 (±s)表示。2样本资料之间的均数比较采用独立样本 t检验。

结 果

1 扩增效率一致性分析

为了利用相对定量的比较 Ct法对 Elf-1 mRNA表达进行定量,将倍比稀释的 cDNA的 log值作为横坐标,ΔCt=[Ct(Elf-1)-Ct(β2M)]作为纵坐标绘制关系曲线,得出 Elf-1与内参照之间的直线斜率的绝对值为 0.066,直线斜率的绝对值接近于 0[7],表明目的基因 Elf-1和参照基因β2M的扩增效率一致,实验结果可以应用公式 2-△Ct×100%进行相对定量。

2 Elf-1扩增产物鉴定

β2M产物的熔解曲线峰值均在 83℃,Elf-1产物的熔解曲线峰值在 82℃,2%琼脂糖凝胶电泳分析显示 Elf-1实时定量 RT-PCR产物片段大小正确,为 152 bp。PCR产物直接序列分析结果与 Elf-1基因序列 (No.001145353)完全一致。

3 Elf-1在CBMCs和 PBMC中的表达

所有检测样本均表达 Elf-1。根据实时定量PCR的相对定量公式:2-△Ct×100%计算 Elf-1的mRNA表达量,结果显示,12例脐带血 Elf-1 mRNA相对表达量为 18.55% ±2.48%,其中最高为36.22%,最低为 6.45%,10例健康成人 Elf-1的mRNA相对表达量为 9.16%±1.92%,均存在个体表达差异性,这种差异尤其以 CBMCs为明显,见图1,CBMCs中 Elf-1 mRNA表达量明显高于 PBMC (P＜0.01)。

Figure 1. Expression of Elf-1 mRNA in UCB and peripheral blood from healthy adults.图 1 Elf-1在脐带血及健康成人外周血中的表达水平

4 Elf-1在CD4+及CD8+T细胞中的表达特点

Elf-1在脐带血及健康成人外周血 CD4+及CD8+T细胞中的表达水平见图 2。12例脐带血CD4+T细胞中 Elf-1 mRNA相对表达量为 3.83% ±0.61%,虽然高于健康成人外周血 CD4+T细胞(2.73%±0.52%),但无显著差异 (P＞0.05)。而脐带血 CD8+T细胞中 Elf-1 mRNA相对表达量相对较高(3.52%±0.45%),其中最高为 6.75%,最低为 1.71%,明显高于健康成人外周血 CD8+T细胞(2.02%±0.27%,P＜0.05)。脐带血中 CD4+T细胞和 CD8+T细胞 Elf-1 mRNA表达水平差别无显著(P＞0.05);成人外周血中 CD4+T细胞和 CD8+T细胞 Elf-1 mRNA表达水平差别无显著(P＞0.05)。

Figure 2. Expression level of Elf-l mRNA in CD4+,CD8+T cells from UCB and peripheralblood of healthy adults.图 2 Elf-1在脐带血及健康成人外周血中 CD4+、CD8+T细胞的表达水平

讨 论

Elf-1是 Ets转录因子家族成员之一,Elf-1基因定位于 13号染色体 13q13,主要表达于造血细胞和成纤维细胞等,调节诱导多种基因的表达,包括CD4、G M-CSF和 TCRζ等。Elf-1蛋白为一种与细胞增殖相关的核蛋白,在 T细胞核中结合于 TCRζ基因的启动子并激活启动转录,是 T淋巴细胞特异性转录因子[8]。TCRζ是 TCR-CD3复合物中最重要的成员,在细胞内外信号传递以及 T细胞的活化增殖中扮演着举足轻重的地位。研究表明,TCRζ链表达缺失或下调不仅影响 TCR在细胞表面的表达,还导致 T细胞信号转导异常及免疫细胞功能障碍[9]。而 TCRζ链的正常表达非常依赖于 Elf-1的调节,在TCRζ基因启动子上有两个特异性的 Elf-1结合位点 zEBS1和 zEBS2,其中 zEBS1是所有 Elf-1结合位点中亲和力最高的,Elf-1与之结合后激活启动TCRζ基因的转录[8]。由于 Elf-1异常而导致 TCRζ基因表达下调在 SLE及口腔癌中均有报道[10,11]。

我们前期研究比较系统地分析了脐带血 T细胞的标型、TCR基因家族分布和相关基因表达情况,并发现 CB CD4+和 CD8+T细胞的 TCRζ基因表达量均明显高于健康成人等特点[3-5]。本研究进一步分析了这些脐带血 T细胞样本中 Elf-1基因的表达水平,结果发现:在脐带血单个核细胞水平上检测显示Elf-1 mRNA表达水平明显高于健康成人对照组,进一步分析分选的 CD4+和 CD8+T细胞中 Elf-1 mRNA表达水平则显示,在 CB CD8+T细胞中,Elf-1基因的表达水平同样高于健康成人对照组,但 CB CD4+T细胞 Elf-1 mRNA的表达水平虽然略高于健康成人对照组,但无显著差异。本研究初步的结果提示 Elf-1基因在脐带血 T细胞表达水平与成人外周血 T细胞中的一些差异和特点,整体结果显示 Elf -1基因在 CB中高表达特点,而在 CD4+T细胞中表达水平比较接近正常人,可能是其一个特点,提示CD8+T细胞和 CD4+T细胞中在 TCR信号通路分子表达上可能存在一些差异,由于不同亚群 T细胞在移植免疫中所发挥作用有明显的不同,与移植排斥和移植物抗宿主病等密切相关,因此,对于 CB中 T细胞相关信号通路基因等系统的分析对于深入了解CB T细胞特点是十分必要的。

总之,本实验率先对脐带血中 Elf-1 mRNA的表达水平进行初步研究,结果提示脐带血中 Elf-1 mRNA的高表达也许是 TCRζ基因高表达的重要因素。但由于 Elf-1 mRNA的表达产物要经过 PKC-θ进行翻译后磷酸化及糖基化修饰才能成为有活性的TCRζ转录因子,因此后续有必要对 Elf-1及 PKC-θ作进一步研究,才能提供更详尽的实验数据。

[1] 吴海江,朱德琳,韓忠朝.脐带血移植的应用进展及脐带血库建设 [J].生命科学,2007,19(2):169-173.

[2] 倪秀雄,陈 玄,张文豪.OK-432增强脐血树突状细胞瘤苗抗胃癌作用的实验研究[J].中国病理生理杂志,2008,24(12):2366-2369.

[3] Li Y,Chen S,YangL,et al.TRAVandTRBVrepertoire, clonality and the proliferative history of umbilical cord blood T cells[J].Transpl Immunol,2007,18(2):151 -158.

[4] Li Y,Chen S,YangL,et al.TRGVandTRDVrepertoire distribution and clonality of T cells from umbilical cord blood[J].Transpl Immunol,2009,20(3):155-162.

[5] 陈少华,李扬秋,杨力建,等.CD3ζ链基因在脐带血T细胞及其 CD4+和 CD8+T细胞亚群中的表达特点[J].免疫学杂志,2008,24(4):452-455.

[6] StamsWA,den BoerML,Beverloo HB,et al.Sensitivity to L-asparaginase is not associated with expression levels of asparagine synthetase in t(12;21)+pediatric ALL [J].Blood,2003,101(7):2743-2747.

[7] Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ctmethod[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[8] Rellahan BL,Jensen JP,Howcroft TK,et al.Elf-1 regulates basal expression from the T cell antigen receptorζchain gene promoter[J].J Immunol,1998,160(6): 2794-2801.

[9] Reichert TE,Rabinowich H,Johnson JT,et al.Mechanis ms responsible for signaling and functional defects[J]. J Immunother,1998,21(4):295-306.

[10]Juang YT,Tenbrock K,Nambiar MP,et al.Defective production of functional 98-kD form of Elf-1 is responsible for the decreased expression of TCR zeta-chain in patientswith systemic lupus erythematosus[J].J Immunol,2002,169(10):6048-6055.

[11]KulkarniDP,Wadia PP,Pradhan TN,et al.Mechanis ms involved in the down-regulation of TCR zeta chain in tumor versus peripheral blood of oral cancer patients[J]. Int J Cancer,2009,124(7):1605-1613.