人脐带间充质干细胞对小鼠自然衰老过程中骨髓脂肪化的影响＊

许婷婷, 周艳华, 李 军, 谭广销, 刘革修

(暨南大学医学院血液病研究所,广东广州 510632)

人骨髓从婴儿出生直到年老,经历了红骨髓向黄骨髓的转变。黄骨髓主要由脂肪组织构成,其造血功能甚微,而且大量的脂肪细胞会明显减慢骨髓中血细胞的形成速度,骨髓的脂肪化在骨质疏松症、股骨头坏死等常见老年疾病中尤为明显,这些变化将严重影响骨髓造血、进而影响人体健康。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是位于骨髓腔内一种具有多向分化潜能、造血支持和免疫调控功能的成体干细胞,可以向成骨和成脂分化,是骨髓脂肪细胞和成骨细胞的来源[1]。本研究拟采用新生儿脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSC)对小鼠自然衰老过程中骨髓脂肪化进行干预研究,观察其是否能抑制脂肪化,以期为延缓造血系统衰老的研究开辟一条新思路。

材 料 和 方 法

1 材料

足月剖宫产健康新生儿的脐带取自暨南大学华侨医院,产妇无传染性疾病,并按 2005年国务院《医院管理条例》第33条规定对产妇的治疗及风险进行如实告知,产妇及其家属对胎盘可能用于科学研究均签署知情同意书,实验方案经医院医学伦理委员会批准。6月龄 SPF级雌性BALB/c纯系小鼠 40只,购自南方医科大实验动物中心 (动物合格证号: 0043640)。DMEMF12培养基、胶原酶Ⅳ和胰蛋白酶均购自Gibco。胎牛血清购自 PAA。PE标记的抗 CD34、CD45、CD106及 FITC标记的抗 CD44、CD29、CDHLA-DR单克隆抗体及小鼠相应的同型对照购自 Becton Dickinson。PPARγ免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术公司产品。地塞米松、胰岛素、抗坏血酸、β-磷酸甘油与油红O购自 Sigma。

2 方法

2.1 间充质干细胞的分离培养与鉴定 (1)脐带MSC 脐带经 PBS液清洗,并剪碎,经等体积 0.2%胶原酶Ⅳ消化 4 h,得到的混悬液过 200目筛网,收集滤过液,用 PBS充分稀释后,离心并漂洗,得到悬浮细胞,计数接种于含 10%FBS的DMEMF12完全培养液的培养瓶中,置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养,3 d后全量换液,弃去非贴壁细胞,约 5 d或细胞融合达 80%时,用 0.25%胰酶消化,按 1∶2传代。以后每 2 d完全换液 1次,约 4 d传代 1次,留第 2-4代细胞备用。(2)成年小鼠骨髓MSC 按本实验室已建立的方法进行,取6月龄小鼠断颈处死后乙醇浸泡,取出双侧股骨并剪开2端,用含 10%FBS的DMEMF12培养基从干骺端反复冲洗骨髓腔,将冲洗下来的液体离心后重悬接种。分别取第 3代骨髓MSC与 hUC-MSC,进行成骨成脂诱导分化。MSC的鉴定采用传代培养、形态观察及流式细胞仪检测其表面标志(CD106、CD45、CD34、CD29、CD44、HLA-DR)及成骨成脂诱导分化实验。

2.2 hUC-MSC与成年小鼠骨髓MSC生长增殖与成骨成脂分化比较 分别取第3代 hUC-MSC、成年小鼠骨髓MSC进行生长曲线测定。成骨细胞诱导采用含有 0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-磷酸甘油、50μmol/L抗坏血酸和含 10% FBS的DMEMF12培养基,分别在诱导培养第 7 d和第 14 d时,收集细胞,加入 PBS放入 -20℃冰箱反复冻融3次,采用以磷酸对硝基苯为底物的动力学测定方法检测细胞碱性磷酸酶活性(ALP)。脂肪细胞诱导采用含有 1μmol/L地塞米松、5×103U/L胰岛素和 5%FBS的DMEMF12培养基进行,观察到胞质中有脂滴形成时,4%多聚甲醛固定、0.375%油红O染色检测。

2.3 hUC-MSC干预小鼠自然衰老过程中骨髓脂肪化的观察 6月龄雌性BALB/c小鼠40只,随机留取8只小鼠,用于成年小鼠骨髓MSC的成骨成脂分化研究,剩下的随机分为实验组和对照组,每组各 16只。饲养于层流无菌环境,无菌饮食、饮水。(1)实验组为MSC干预组:经尾静脉输注第 2代hUC-MSC 0.1 mL(含 5×105个细胞),每个月后重复输注hUC-MSC 1次,共 6次;(2)对照组为未干预组:相应经尾静脉输注 0.1 mL生理盐水。于第 6个月处死小鼠,得到的股骨快速放入 4%的盐酸甲醛脱钙固定液中,12 h后进行常规脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片,HE染色后在显微镜下观察骨髓造血组织情况并摄像。同时取部分骨髓组织切片,采用免疫组织化学染色检测 PPARγ蛋白的表达 (操作步骤按试剂盒说明进行),从分子水平了解骨髓成脂分化情况。

3 统计学处理

结 果

1 人脐带间充质干细胞的分离、培养及免疫表型鉴定结果

观察发现,采用上述方法从脐带组织中分离的细胞,一部分于 12 h内开始贴壁,3 d内大部分细胞贴壁,细胞呈梭形、多角形,并可见多个细胞形成集落,但仍有圆形细胞混杂其中。4-5 d后传代,传代后的细胞主要呈长梭形,形态较原代均一,以平行排列生长为主,或呈漩涡状生长。第3代细胞经成骨成脂分化诱导,可分化为成骨细胞和脂肪细胞;流式细胞术检测,人脐带MSC强表达 CD44、CD29,不表达造血干细胞标志CD34和CD45,不表达HLA-DR和CD106。

2 hUC-M SC与成年小鼠骨髓M SC生长增殖与成骨成脂分化的比较结果

hUC-MSC生长曲线呈上升陡直的“S”形,接种后第 1、2 d为潜伏适应期,从第 3 d细胞开始增殖加速并进入对数生长期,第 5-6 d达到高峰,以后进入平台期。成年小鼠骨髓MSC生长曲线呈上升迟缓的“S”形,细胞倍增速度慢。MSC经成脂诱导后,形态发生明显变化,由长梭形变成类圆形、圆形细胞,胞浆内有很多脂滴形成。油红O染色后,可以看到 2组MSCs内均有红色脂滴。与 hUC-MSC相比,骨髓MSC组发生形态改变的细胞数量多,脂滴形成的时间早 (第 6 d出现)且体积大,而 hUC-MSC组脂滴形成晚(第 11 d出现)且呈碎点状分布,见图 1A、B。ALP是MSC成骨分化后最早出现的成骨性标志,2组ALP表达量变化见表 1,在成骨诱导后第 7 d,2组ALP表达量无明显差异 (P＞0.05);在成骨诱导后第 14 d,hUC-MSC组ALP表达量明显增加,是骨髓MSC组的2.3倍(P＜0.01),差异显著。这些结果说明 hUC-MSC属于原始年轻的MSC,具有更强的生物学功能。

表1 成骨诱导后第 7 d、14 d时各组细胞 ALP表达量Table 1 . The expression level ofALP on 7 d,14 d(±s.n=8)

表1 成骨诱导后第 7 d、14 d时各组细胞 ALP表达量Table 1 . The expression level ofALP on 7 d,14 d(±s.n=8)

▲▲P＜0.01vsbone marrowMSC group.

?

3 hUC-M SC输注对小鼠骨髓病理变化及 PPARγ蛋白表达的影响

实验组骨髓切片的造血组织明显多于对照组,有核细胞较多;而对照组骨髓切片的脂肪组织明显多于实验组,见图1C、D、E、F。PPARγ蛋白阳性表达为棕色,多定位于基质细胞胞浆内,也有部分位于胞核内,实验组骨髓细胞中 PPARγ蛋白的阳性表达明显低于对照组,见图 1G、H。

Figure 1.Lightmicroscopy image of cells.A:the differentiation of hUC-MSC to adipose cells;B:the differentiation of bonemarrow MSC to adipose cells(oil red O,×200);C,D:cross and longitudinal section of bone marrow in experimental group;E, F:cross and longitudinal section of bone marrow in control group(HE,×50);G:immunohistochemistry staining for PPARγof exper imental group;H:immunohistochemistry staining for PPARγof control group(SP,×200).图 1 光学显微镜下的细胞形态

Figure 2.Growth curve of hUC-MSC and bone marrow MSC.图2 hUC-M SC和成年小鼠骨髓M SC的生长曲线

讨 论

本研究结果发现,hUC-MSC属于较原始的MSC,比中老年小鼠骨髓MSC具有更强的生物学功能,给中老年小鼠定期输注该细胞,其骨髓组织切片观察发现实验组造血组织比同期对照组丰富、脂肪化轻;未经 hUC-MSC干预的小鼠骨髓细胞 PPARγ蛋白表达量明显高于 hUC-MSC干预小鼠。这些结果说明 hUC-MSC干预可抑制小鼠自然衰老进程中骨髓的脂肪化,可用于造血系统抗衰老研究,根据现有资料推测其机制可能有多方面因素。

骨髓MSC是骨髓中成骨细胞和脂肪细胞的共同来源,在个体正常发育过程中,这 2种分化途径通过 TEG-β、BMPs、PPARγ2、生长激素、1,25(OH)2D3和雌激素等的调节而维持在平衡状态[2]。当机体年轻时,骨髓MSC成骨相关基因表达活跃,分泌成骨刺激因子,促进成骨分化;这些因子也可能抑制MSC成脂基因的表达,使得该平衡趋向于成骨细胞方向分化,这不仅参与骨组织的构成,还是修复 HSC壁龛的关键细胞成分,同时年轻的MSC可以分泌许多造血干细胞 (hematopoietic stem cell,HSC)相关生长因子,促进造血。当机体逐渐衰老时,骨髓MSC数量与活性不断下降,成骨相关基因表达减少,相反地,与成脂相关的基因逐渐活跃并表达,介导MSC成脂分化过程中起关键性作用的转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)[3]表达升高[4],使得该平衡转为成脂分化占优势,导致骨髓中脂肪组织增多。此时,首先成骨受到抑制,HSC龛位减少,黏附分子也发生改变,进而抑制了造血干/祖细胞的增殖和分化;其次,骨髓内的脂肪细胞可诱导骨髓MSC的凋亡[5];再则,骨髓中HSC与MSC是相互作用相互影响的细胞体系,当机体进入老年阶段时,HSC和MSC都会出现衰老,出现相互削弱对方作用的恶性循环,骨髓造血被进一步抑制。

从上述分析中我们认为将具有更强生物学功能的 hUC -MSC定期输给逐渐老年的小鼠体内,不仅其自身可以进行成骨分化,提供 HSC龛位;还分泌许多细胞因子,如:神经生长因子、血管内皮生长因子、干细胞生长因子、Flt-3 ligand、TPO、L IF、 IL-6和 IL-11等[6,7]。这些细胞因子可以积极作用于老年小鼠 HSC,促进其增殖分化,而后者可能又反过来支持促进自身的骨髓MSC,形成互相促进的良性循环;也可能作用于小鼠自身的骨髓MSC,上调其成骨分化的相关基因,下调成脂分化基因的表达,抑制骨髓脂肪化。

综上所述,本研究证实了 hUC-MSC可以抑制小鼠自然衰老进程中骨髓的脂肪化,为老年股骨头坏死、骨质疏松症等骨髓过度脂肪化疾病提供了新的思路。但是调节MSC分化的分子机制很复杂,其抑制骨髓脂肪化的具体机制还不清楚,仍需进一步的实验证明。

[1] 刘 宁,杨淑野,王双利,等.骨髓间充质干细胞与仿生纳米壳聚糖 -胶原复合物修复大鼠胫骨缺损的实验研究[J].中国病理生理杂志,2008,24(6):1161-1165.

[2] NuttallME,Gimble JM.Controlling the balance between osteoblastogenesis and adipogenesis and the consequent therapeutic implications[J].CurrOpin Pharmacol,2004, 4(3):290-294.

[3] Khan E,Abu-Amer Y.Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma inhibits differentiation of preosteoblasts[J].J Lab ClinMed,2003,142(1):29-34.

[4] Jais wal RK,Jais wal N,Bruder SP,et al.Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated bymitogen-activated protein kinase[J].J Biol Chem,2000,275(13):9645-9652.

[5] 王华松,陈庄洪,罗永湘.髓内脂肪细胞促骨髓基质细胞凋亡的实验研究 [J].中国骨质疏松杂志,2005,11 (3):325-328.

[6] 朱光荣,周小玉,陆 化,等.人骨髓间充质干细胞表达多种造血细胞因子[J].中国实验血液学杂志,2003,11 (2):115-119.

[7] MaitraB,Szekely E,Gjini K,et al.Humanmesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation[J].Bone Marrow Transplant,2004,33(6):597-604.