低温烷烃降解菌Yarrowia sp.分离、鉴定及降解特性

马会强，张兰英，张洪林，李爽

（1.辽宁石油化工大学 环境与生物工程学院，抚顺 113001；2.吉林大学 环境与资源学院，长春 130026）

地下水资源在人类生活和工农业生产中占据着十分重要的地位［1］，然而随着国民经济的飞速发展，在石油开采及制品生产、储存、运输、使用等过程中，频繁出现地下水受石油烃污染事件［2］，因烷烃在原油及制品如柴油、煤油组分占有较高的比例（>80%），所以有效消除烷烃是石油烃污染环境控制与修复成败之关键。许多烷烃污染物可以在环境中被微生物有氧和厌氧降解，烷烃的生物修复因可行、有效和优越等优点，早在1975年就被应用于国外石油烃污染场地修复中，后来得到美国环保署、国防部、能源部等科研机构积极推广［3，4］。在影响污染物生物修复因素中温度首当其冲，国内外学者开展了众多常温条件下烷烃降解菌的筛选、降解特性及机理、摄取模式研究，其成果在石油烃污染土壤及地表水控制治理中得到良好效果及广泛应用；但低温条件下（≤15℃）的烷烃生物降解研究报道甚少［5］。特别是在地下水(10℃左右)环境中，大部分微生物新陈代谢会受到极大抑制，严重影响了生物修复效率［6］，因此筛选具有低温 10℃降解烷烃能力菌株对于石油烃污染地下水的生物修复具有重要意义。

本研究从长期受原油污染—场地中富集、分离、筛选能够有效降解地下水中石油烃菌株，对低温高效降解菌进行18S rDNA碱基序列分析及系统发育分类鉴定，研究其烷烃降解能力及广谱降解性。

1 实验部分

1.1 材料

菌株源自某油田长期受原油污染场地；正十五烷(纯度>99%)、正十六烷(纯度>98%)日本 TCI公司；0#柴油：中国石油天然气公司；实验用水采自东北某地区地下含水层。

1.2 培养基

无机盐培养基：K2HPO41550，NaH2PO4850，(NH4)2SO42000，MgCl2· 6H2O 100，EDTA 10，ZnSO4· 7H2O 2.0，CaCl2· 2H2O 1.0，FeSO4·7H2O 5.0，NaMoO4· 2H2O 0.2，CuSO4· 5H2O 0.2，CoCl2· 6H2O 0.4，MnCl2· 2H2O 1.0；pH 7.0；单位：(mg/L)。驯化培养基：无机盐培养基中加入一定浓度0#柴油，pH 7.0。富集培养基：驯化培养基中加入葡萄糖5，酵母膏1，pH7.0，单位：g/L。

1.3 仪器

HZQ-F160型振荡培养箱(哈尔滨)；LRH-25A型生化培养箱(广东)；GC6890-MS5973N型气相色谱质谱联用仪(美国)；PTC-200型 PCR仪(美国)；C2500-R-230V型高速冷冻离心机(美国)等。

1.4 试验方法

1.4.1 低温强化富集与分离

冬季采集污染场地土壤样品，进行如下低温强化富集：第一阶段：将土壤样品无菌水悬浮，高速搅拌 30min，八层纱布过滤杂物，静止 1h，取50mL悬浊液接至200mL富集培养基，10℃低温，120rpm培养15d，然后取适量菌悬液重新接至新鲜富集培养基，10℃低温适应；而后连续传代5次，每次9d，逐渐减少辅助碳源用量，直至石油烃为唯一碳源；第二阶段：将上述菌悬液接至驯化培养基，继续10℃低温适应、富集，直至菌群降解功能稳定、不能有效缩短降解时间为止。将最终菌悬液，稀释、涂布、划线分离至纯菌株。

1.4.2 生理生化特性测定及DNA提取

生理生化特性试验方法见参考文献［7］，总DNA提取方法见参考文献［8］。

1.4.3 18S rDNA引物、PCR扩增及序列测定

18S rDNA基因的PCR扩增引物：上游引物：5'-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'；下游引物：5'-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3'。

PCR扩增条件：95℃预变性10min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。取5L反应液与1L 6×上样缓冲液混合，在1%的琼脂糖凝胶中，于80V电压下电泳检测。

引物合成及PCR产物测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。

1.4.4 菌株降解烷烃效果

将菌株接种至烷烃无机盐培养基（正十五烷、正十六烷浓度为50mg/L），置于10℃，120rpm摇床培养，定时取样测定烷烃浓度。

1.4.5 菌株烷烃广谱降解性

将菌株接种至柴油无机盐培养基（柴油浓度为400mg/L），空白对照，置于10℃，120rpm摇床培养，4d萃取处理后进行GC/MS全扫描定性分析。

1.4.6 石油烃测试方法

石油烃浓度参考EPA 8270C方法，采用液-液萃取-GC/MS进行定性、定量分析。色谱条件：进样体积：1.0L；不分流进样；进样口温度：280℃；石英毛细管柱（HP-5MS）；柱流量 1mL/min；炉温：50℃保持2.0min，50℃至270℃，升温速率8.0℃/min，保持5min。质谱条件：MSD检测器；EI源；电子倍增电压：2071V；离子源温度：230℃；Scan模式：质量：45-400，扫描速度：4.05 Scans/Sec；SIM模式：正十五、十六烷抽取离子为57、71、85。

2 结果与讨论

2.1 低温烷烃降解菌富集与分离

经 120d低温强化富集，最终得到一组可在10℃低温下稳定降解石油烃的混合菌群，经分离得到 6株纯菌，分别进行降解效果测试（10℃，400mg/L柴油），结果如图1所示。

图1 不同菌株对石油烃的降解效果Fig.1 Degradation of PHs by different bacteria

由图1可知，A、H菌对石油烃均具有较好的降解能力，3d降解率大于80%，A菌降解率稍高（86%），本文选择A菌作为实验菌株。

2.2 菌株生理生化特性

将A菌10℃恒温培养2d后，菌落观察为：白色、不透明、0.5-0.7mm大小、凸面、规则圆形、边缘整齐、表面有褶皱。将菌株染色后进行显微镜观察可知：该菌为酵母菌（部分正进行裂殖），革兰氏阳性，结果如图2所示。

图2 菌体形态Fig.2 Morphology of bacteria

对A菌进行了18项生理生化试验，测试结果见表1所示。

表1 菌株生理生化试验结果Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of bacteria

2.3 菌株18S rDNA系统发育及鉴定

菌株18S rDNA经 PCR扩增后，得到长度为1300bp左右的基因片段，测序后将菌株rDNA序列输入 GenBank（http//:www.ncbi.nlm.nih.gov），以BLAST软件进行序列同源性比较，选择同源性大于98%的基因序列，用ClustalX（1.83）多重同源序列分析并经人工仔细核查后，用 Phylip3.6软件进行Neighbor-joining法构建系统发育树，邻接树使用Jukes-Cantor法，系统树各分支的置信度由自引导法（Bootstrap）100次重复检测。结果如图3所示（发育树图中结点处数字为bootstrap值，括号内为序列登录号）。

由图3可知：A菌与解脂耶氏酵母菌Yarrowia lipolytica(DQ438182)进化距离较近，并结合生理生化特性，判定A菌株在分类学属性为：耶氏酵母菌属（Yarrowiasp.）。解脂耶氏酵母菌（Yarrowia lipolytica）是非常规酵母中具代表性的一种，它底物广泛，尤其能利用乙酸和脂肪酸、烃类等物质为碳源进行生长，具有适应较恶劣环境条件和抵抗致病菌生长的能力，这些特点使Yarrowiasp.适用于有机固体废弃物及油脂废水方面的治理［9，10］。而本文筛选的耶氏酵母菌可在10℃低温条件下快速降解石油烷烃，拓宽了该菌属的应用领域。

图3 菌株基于18S rDNA序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 18S rDNA series of bacteria

2.4 菌株降解烷烃效果

将A菌接种至奇数、偶数烷烃（正十五、正十六烷50mg/L）模拟液中，10℃下对其降解效果如图4所示。

图4 菌株正烷烃降解效果Fig.4 Degradation of n-alkanes by bacteria

由图4可知，低温条件下菌株对奇、偶数正烷烃具有良好的降解效果，36h降解率均大于85%。

2.5 菌株烷烃广谱降解特性

为探究菌株对烷烃的广谱降解性，将 A菌4d降解后的 0#柴油样品和空白组进行 GC/MS全扫描，利用标准谱图库检索和工作站中OverlayChromatograms功能对菌株所能降解污染物进行识别，结果如图5所示。由图可知：柴油（空白对照）中石油烃成分复杂，主要含有C12-C27烷烃、芳香烃及衍生物；经与A菌降解谱图对比可知：菌株对烷烃具有很宽的广谱降解性，能够有效降解：C12-C27正构烷烃、支链烷烃、环烷烃，并对难被生物利用的姥鲛烷、植烷也具有一定降解能力。

上述菌株的低温烷烃降解能力，为其下一步在北方项目区石油烃污染土壤及地下水的生物修复提供了新参考。

图5 菌株烷烃广谱降解特性Fig.5 Broad-spectrum degradation capability of alkanes by bacteria

3 结论

从长期受原油污染—场地中经过120d低温强化富集、驯化、分离，筛选出1株能在低温条件下（10℃）对柴油具有较高降解能力的A菌，3d降解率为 86%；经形态观察、生理生化特性及 18S rDNA鉴定判定该菌在分类学上属于耶氏酵母菌属（Yarrowia sp.）。

耶氏酵母菌具有广泛且有效的烷烃降解特性，能有效降解奇数、偶数正构烷烃，以及柴油中的C12-C27正构烷烃、支链烷烃、环烷烃，并对姥鲛烷、植烷也具有一定降解能力。

耶氏酵母菌在10℃低温下对石油烷烃的广泛且有效降解特性，为其在低温地区的石油烃污染土壤及地下水生物修复中的应用奠定了基础。

［1］罗兰.我国地下水污染现状与防治对策研究［J］.中国地质大学学报：社会科学版，2008，8（2）：72-75.

［2］He L，Huang G H，Zeng G M，et al.An integrated simulation，inference，and optimization method for identifying groundwater remediation strategies at petroleum contaminated aquifers in western Canada［J］.Water Research，2008，42（10-11）：2629-2639.

［3］赵勇胜.地下水污染场地污染的控制与修复［J］.吉林大学学报：地球科学版，2007，37（2）：303-310.

［4］U.S.EPA.A citizen's guide to natural attenuation（EPA：542-F-96-015）［M］.Washington DC：National Service Center for Environmental Publication，1996c.

［5］黄磊，李丹，孙丹，等.1株低温石油烃降解菌的分类鉴定及降解特性研究［J］.环境科学，2007，28（9）：2101-2105.

［6］马会强，张兰英，李爽，等.低温混合菌降解硝基苯的研究［J］.环境科学与技术，2007，30（12）：5-7.

［7］马放，任南琪，杨基先.污染控制微生物实验［M］.哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2002.

［8］马会强.石油烃污染地下水的原位生物修复研究［D］.长春：吉林大学，2009.

［9］徐同宝，李吕木，蔡海莹，等.一株解脂耶氏酵母菌的鉴定及其系统发育树分析［J］.安徽农学通报，2008，14（13）：29-30.

［10］吴兰，万金保.固定化解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）处理油脂废水的性能研究［J］.环境工程学报，2008，2（4）：482-486.