STZ诱导小鼠DM模型及其机制的研究

王 叶,邢 杰

（1.吉林大学中日联谊医院,吉林长春 130033;2.吉林大学第二医院）

目前糖尿病（DM）的研究多采用动物模型进行研究,与人1型糖尿病（T1DM）发病机制最为相似的动物模型是NOD小鼠,但价格昂贵,来源和饲养困难,实验周期长。目前,多采用化学药物STZ（STZ）诱导鼠DM模型,此方法诱导的DM模型能否作为T1DM模型,目前尚有争论,机制依STZ的剂量不同而有所不同。本研究应用小剂量多次腹腔注射STZ诱导小鼠DM模型,探讨其诱导的小鼠DM模型类型及其机制,为小鼠DM模型的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物、试剂与仪器 雄性ICR（Institute of Cancer Research,ICR）小鼠30 只,体重16-18 g,由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。STZ购自美国sigma公司,便携式血糖检测仪及血糖试纸购自德国罗氏公司;胰岛素（INS）放免试剂盒购自潍坊三维生物工程集团有限公司;IFN-γ和IL-4酶联免疫试剂盒购自深圳达科为生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型制备 将雄性ICR小鼠30只适应喂养1周后随机分成模型组（A组）和正常对照组（B组）。A组（n=20）,连续5天腹腔注射STZ（60 mg·kg-1）;B组（n=10）,连续五天腹腔注射等容量枸橼酸盐缓冲液。各组于末次注射STZ后每周测血糖1次,血糖水平连续2次高于16.7mmol/L为成模标准。6周后处死。造模期间死亡动物不计入统计资料。

1.2.2 检测指标及方法 实验过程中观察小鼠一般状态、饮水、进食、尿量、体重、体毛和活动等情况,便携式血糖仪测定血糖;实验结束后摘眼球取血,静置30分钟后分离血清,分装置-20℃冰箱保存。HE染色光镜下观察胰岛细胞。放射性免疫方法测定血清INS含量（按试剂盒说明书操作）。ELISA检测小鼠血清中IFN-γ和IL-4水平（按试剂盒说明书操作）。

1.2.3 统计学分析 所有数据采用SPSS11.0统计软件包分析。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状态 A组小鼠实验期间出现饮水量、进食量、尿量明显增加,体毛无光泽,活动减少,体重明显下降,然后呈缓慢增长趋势;B组小鼠状态正常,体重稳步增长。

2.2 血糖水平比较 注射STZ前两组血糖水平无明显差异（P＞0.05）,注射STZ后A组血糖逐渐升高,至第4周与第6周稳定在较高水平,DM模型成立。见表1。

表1 STZ对T1DM小鼠血糖水平的影响（±s±s）组别 n 注射STZ前血糖（mmol/）注射STZ后血糖（mmol/L）1周 2周 3周 4周 6周A组 19 6.17±0.63 9.81±4.28ab 12.60±4.62ab 16.07±4.44ab 20.31±2.72ab 20.77±4.15ab B组 10 5.99±0.76 5.86±0.68 6.23±0.61 6.05±0.58 6.09±0.71 6.51±0.67 a表示与注射前比较 P＜0.05,b表示与B组比较P＜0.05

2.3 胰腺病理 B组胰岛数目较多,呈现圆形或椭圆形细胞团状,边界清楚,高倍镜下,胰岛内细胞数目较多,排列整齐,胞浆丰满,核多为圆形;A组胰岛数目稀少 ,形态不规则,高倍镜下,可见胰岛细胞数目减少,胞体缩小,边界不清,细胞核大小、形态不规则,部分胰岛细胞发生空泡变性,有少许淋巴细胞,单核细胞浸润现象。见图1、图2。

图1 B组（HE染色400×） 图2 A组（HE染色400×）

2.4 血清INS水平比较 A组血清INS含量明显低于B组（P＜0.05）见表2。

2.5 血清IFN-γ和IL-4水平比较 A组IFN-γ水平升高、IL-4水平降低、IFN-γ/IL-4比值增大,与B 组比较均有显著性差异（P＜0.05）,见表3。

表2 各组血清 INS水平（±s±s）组别 例数 血清胰岛素（μIU/m l）A 组 16 23.81±2.95 B组 10 42.92±7.73

表3 各组血清中IFN-r和IL-4水平（±s±s）

表3 各组血清中IFN-r和IL-4水平（±s±s）

组别 例数 IFN-γ（pg/ml） IL-4（pg/ml） IFN-γ/IL-4 A组 12 53.20±9.07 22.31±6.00 2.54±0.80 B组 8 29.04±3.34 40.84±10.54 0.74±0.18

3 讨论

目前研究认为T1DM是T细胞介导的胰岛β细胞选择性破坏的自身免疫性疾病[1,2],免疫耐受的破坏和Th1/Th2失调是其发病的重要环节[3]。Th1型细胞产生的IFN-γ、IL-2、TNF-α具有胰岛β细胞毒效应,是T1DM发病中主要损害胰岛的因素之一[4]。Th2型细胞产生的IL-4、IL-10具有强烈抑制Th1型细胞产生某些细胞因子的作用,减轻T1DM发病[5-7]。

STZ是从无色链霉素菌属分离出的一个广谱抗菌素,具有活泼的烃基结构,可以直接损伤胰岛β细胞DNA,刺激其释H2O2。过量的H2O2及其转化形成的羟自由基引起DNA断裂,增加脂质过氧化物水平,抑制胰岛素释放[8]。能抑制线粒体功能,降低β细胞代谢和胰岛素分泌[9]。STZ存在亚硝基基团,可产生胰岛β细胞毒物质NO。NO参与许多自由基级联式反应,诱导胰岛β细胞凋亡。一次大剂量（200 mg/kg BW）应用STZ可集中大量破坏β细胞,数天后可产生持续性高血糖,这种糖尿病的产生与免疫应答的变化无关[10]。

本实验观察到,STZ连续多次小剂量注射后,模型组小鼠与正常对照组相比,出现多饮、多尿、多食、体重下降、体毛无光泽,活动减少,且症状是逐渐加重;血糖逐渐升高,血糖与发病率同步升高并非突发过程,至第4周时才达到并稳定在一个较高水平;血清胰岛素水平下降;说明从胰岛β细胞代谢偏移到糖尿病发作经过较长时间的潜临床状态,对胰岛的损害是一个渐进发生、逐步加重的过程。DM组小鼠胰岛内可见炎性细胞浸润,部分胰岛细胞发生空泡变性,形态学的改变符合1型糖尿病的病理学特征即胰岛非特异性炎症伴选择性β细胞破坏[11]。糖尿病组小鼠IFN-γ水平升高、IL-4水平降低、IFN-γ/IL-4比值增大,Th1/Th2失衡,从而引起Th1介导的细胞免疫应答,造成胰岛β细胞损害,导致T1DM的发生,与国内外报导一致[12,13],符合人类T1DM的发病机制,是制备研究T1DM动物模型的理想方法。

[2]闫彩风,张志利,郭清华.T细胞接种对环磷酰胺处理NOD小鼠糖尿病的影响[J].中华内分泌代谢杂志,2001,17:11.

[3]Rabinovitch A.Immunoregulatory and cytokine imbalances in the pathogenesisof IDDM[J].Diabetes,1994,43（5）:613.

[4]Kang MK,Yoon YE,Yang JY,et al.Protective effect of retin-oic acid on cytotoxicity of pancreatic beta-cells[J].Mech Ageing Dev,2004,125（7）:483.

[5]Calcinaro F,Gambelunghe G,Lafferty KJ.Protection from autoimmunediabetesby adjuvant therapy in the non-obesediabeticmouse:the roleof interleukin-4 and interleukin-10.:Immunol Cell Biol,1997,75（5）:467.

[6]Cameron MJ,A rreaza GA,Zucker P,et al.IL-4 prevents insulitis and insulin-dependent diabetesmellitus in nonobese diabeticmiceby potentiation of regulatory T helper-2 cell function[J].Immunol.1997,159（10）:4686.

[7]常 颖,张桂珍,高 申,等.抗氧化微量营养素对糖尿病小鼠细胞因子基因表达的调控用[J].中国实验诊断学,2004,8（1）:42.

[8]Kaneto H,Fujii J,Seo HG,et al.Apoptotic cell death triggered by nitric oxide in pancreatic beta-cells[J].Diabetes,1995,44（7）:733.

[9]Kwon NS,Lee SH,Choi CS,et al.Nitric oxide generation from streptozotocin[J].FASEB J,1994,8（8）:529.

[10]Kim YT,SteinbergC.Immunologic studieson the induction ofdiabetes in experimentalanimals.Cellular basis for the induction ofdiabetesby streptozotocin[J].Diabetes,1984,33（8）:771.

[11]Itoh N,Hanafusa T,Miyazaki A,et al.Mononuclear cell infiltration and its relation to the expression ofmajor histo-compatibility complex antigens and adhesion molecules in pancreas biopsy specimens from new ly diagnosed insulin-dependent diabetes mellitus patients[J].JClin Invest,1993,92（5）:2313.

[12]杨 巍,刘 丹,于春雷,等.STZ诱导小鼠糖尿病模型中 T、B淋巴细胞功能的变化[J].中国免疫学杂志,2006,22（8）:754.

[13]Li RJ,Qiu SD,Chen HX,et al.Immunomodulatory effects of Astragalus polysaccharide in diabeticmice[J].Zhong Xi YiJie He Xue Bao,2008,6（2）:166.