人肥大细胞类糜蛋白酶分泌型真核表达载体的构建

唐晓磊,何素辉,梁晓东,陈章权

(广东医学院,广东东莞 523808)

肥大细胞类糜蛋白酶(MC-Chy)是肥大细胞中一种重要的炎症介质,近年来研究表明它在变态反应性疾病、高血压、动脉粥样硬化、肿瘤、肺纤维化等疾病发生发展中的起着重要的病理生理作用[1,2],国内相关报道较少。由于分离纯化天然的MC-Chy极为困难,为获取分泌表达的重组MC-Chy,进一步深入研究MC-Chy的免疫病理作用,2009年10月～2010年3月,我们进行了MC-Chy分泌型真核表达载体的构建。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 pGEM-T载体为Promega公司产品, DNA凝胶回收与质粒抽提试剂盒为QiaGen公司产品,Kpn I、Xho I限制性内切酶和T4 DNA连接酶为Takara公司产品,pcDNA3.1表达载体、含肥大细胞类糜蛋白酶基因的质粒和大肠杆菌DH5α由本研究室保存。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计 根据Genbank中人MC-Chy的编码序列进行引物设计,用人免疫球蛋白 κ链的信号肽编码序列置换人MC-Chy自身的信号肽序列,设计一对特异引物,即P1：5′-GGTACCATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTA CTCTGGCT CCCAGACACCACTGGAGAAGAGATCATCGGGGGCA CAGAATGC-3′(下划横线为KpnⅠ酶切位点,下划波浪线为人免疫球蛋白κ链信号肽编码序列);P 2：5′-CTCGAGTTAATTTGCCTGCAGGATCTGGTT-3′(下划横线为Xho I酶切位点)。

1.2.2 基因扩增 以本研究室制备含MC-Chy基因的质粒pDEST17/CMA[3]为模板,用上述引物进行PCR扩增。反应条件：94℃变性30 s、65℃退火30 s、72℃延伸 30 s,30个循环后,72℃延伸 45 s。PCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化,将纯化的PCR产物与pGEM-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,转化菌液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的Luria-Bertani(LB)平板上,37℃培养过夜,挑取单个白色菌落进行培养,提取重组质粒,以KpnⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定,并选取阳性克隆DNA测序,用Blast软件进行DNA序列同源性分析,阳性克隆命名为pGEM-T/Chy。

1.2.3 真核表达载体的构建 将质粒pGEM-T/ Chy和pcDNA3.1分别用KpnⅠ和XhoⅠ进行双酶切,并分别纯化回收目的片段。回收产物经T4 DNA连接酶连接后,转化感受态大肠杆菌 DH 5α,转化菌液涂布于含Amp(100μg/ml)的LB平板上,37℃培养过夜。挑取白色菌落进行增菌培养,提取重组质粒,用PCR与Kpn I、Xho I进行双酶切鉴定后,将阳性克隆进行 DNA测序鉴定,阳性克隆命名为pcDNA3.1/Chy。

2 结果

2.1 PCR扩增结果 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,见有1条约750 bp的条带(见图1),与预期结果相符。克隆入pGEM-T载体,经Kpn I和Xho I双酶切,电泳分析显示切下约750 bp的DNA片段(见图2),DNA测序结果表明,插入了687 bp的Chy基因,在其上游成功连接了60 bp的人免疫球蛋白 κ链信号肽基因,阅读框正确,同源性分析显示插入的人MC-Chy编码区基因与Gen-Bank中的DNA序列一致。

2.2 重组质粒构建与鉴定结果 经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切从pGEM-T/Chy切下目的片段,纯化、回收后与经同样双酶切回收的pcDNA3.1片段相连接,构建pcDNA3.1/Chy质粒。挑取5个菌落,PCR鉴定出2个阳性克隆(见图3),进一步Kpn I和Xho I双酶切鉴定显示切下约750 bp的DNA片段,与预期结果相符。DNA测序结果表明目的片段正确插入表达载体pcDNA3.1。Blast同源性分析显示,目的基因及连接在其上游的信号肽基因无突变,阅读框正确,可用于进一步的重组表达。

3 讨论

肥大细胞存在于机体的许多组织中,具有许多生物功能,不仅在免疫应答和免疫调节中发挥重要的生物学作用,也在变态反应性疾病、炎症、心血管疾病、肿瘤等发生发展过程中起着重要的免疫病理作用[1,4,5]。其作用是通过细胞活化脱颗粒、释放炎症介质实现的。其炎症介质分为预先合成介质和新合成介质,其中预先合成介质以组胺和中性蛋白酶等为主,肥大细胞中性蛋白酶主要包括肥大细胞羧肽酶、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶等[1],这些中性蛋白酶与肝素紧密结合成大分子混合物储藏于肥大细胞颗粒内,随着肥大细胞的活化释放出细胞外发挥作用。

图1 PCR产物凝胶电泳结果

图2 重组质粒pGEM-T/Chy酶切鉴定结果

图3 pcDNA 3.1/Chy重组质粒PCR鉴定结果

MC-Chy国外研究较多,国内相关的研究报道较少。目前的研究表明MC-Chy具有增加微血管的通透性和引起炎性细胞浸润、刺激成纤维细胞的增殖、诱导平滑肌细胞及细胞凋亡、促进肿瘤血管生成、刺激胶原蛋白的合成并促进纤维化的形成等作用[1,4～6]。因此,其在哮喘、高血压、动脉粥样硬化、肿瘤、肺纤维化等疾病的发生和发展中发挥重要作用,是变态反应性疾病和心血管疾病的一个新治疗靶点[2]。肥大细胞活化产生介质具有多样性,甚至产生生化作用相反的介质,其中MC-Chy就有类似性质,它能水解血管紧张素Ⅰ生成血管紧张素Ⅱ,而同样属于中性蛋白酶的肥大细胞羧肽酶则能水解血管紧张素Ⅱ,生成生物学作用与其相反的血管紧张素1-7[7],MC-Chy能水解大分子内皮素生成具有高度缩血管活性的内皮素 1[8],而肥大细胞羧肽酶则能降解内皮素 1[9]。目前仅了解这些肥大细胞中性蛋白酶的生物学活性,但对于它们在相关疾病发生发展过程中的作用尚不清楚。

天然的肥大细胞中性蛋白酶分离纯化以及纯化后酶活性的保存均非常困难。因此,我们拟用重组蛋白进行相关研究。MC-Chy属于预先合成的介质,存在于肥大细胞胞质颗粒中,它本身含有信号肽,当细胞活化后才能释放至细胞外。在进行重组蛋白制备时,若保留其本身信号肽,重组蛋白能否分泌出细胞外迄今尚未见报道。为使产物分泌后表达,本实验选择高效分泌表达的免疫球蛋白 κ链信号肽与成熟MC-Chy基因融合,通过PCR扩增获取融合有免疫球蛋白κ链信号肽的MC-Chy基因片段,通过酶切连接插入真核表达载体pcDNA3.1,成功构建了人MC-Chy分泌型真核表达载体。此前我们成功构建了人肥大细胞羧肽酶分泌型真核表达载体,这些工作的完成为重组肥大细胞羧肽酶与MC-Chy的制备及探讨二者在相关疾病发生发展过程中的作用奠定了基础。

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