乳腺癌研究及治疗新靶点—乳腺癌干细胞的研究进展

刘为军 王昆华 龚昆梅 张勇学

云南省第一人民医院普外一科，昆明医学院附属昆华医院，云南 昆明 650032

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤［1］。约有50%的乳腺癌患者经手术治疗后可治愈，其他患者在治疗后5年内出现复发及转移而导致治疗失败，且复发及转移是导致患者死亡的主要原因。随着人们对乳腺癌发生、发展机制的深入研究，乳腺癌干细胞日益受到重视。

1 乳腺癌干细胞基本特征 肿瘤干细胞学说认为，肿瘤组织中的癌细胞的生物学特性不尽相同，即肿瘤组织内的细胞本身具有异质性，其中一小群细胞数目极其稀少，分化缓慢，但其成瘤能力较强，多具有与干细胞相似的自我更新能力和一定的分化潜能，并表达某些正常干细胞相同的细胞标记蛋白。同样，乳腺癌中也存在着此类细胞，即所谓的乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells，BCSCs），BCSCs被认为是肿瘤发生、发展与维持的基础，与肿瘤的复发、转移和对治疗的耐受有关。目前研究认为只有少数BCSCs进入细胞周期，而多数BCSCs处于静止状态，故BCSCs对常规的化疗药物并不敏感。现有的物理、化学药物治疗手段所针对的是大多数的肿瘤细胞，对肿瘤中少数的BCSCs无法达到最有效的杀灭效果，不能防止恶性肿瘤的复发及转移，而肿瘤的复发与转移是患者死亡的主要原因。

2 乳腺癌干细胞标志物和高表达分子

2.1 ESA+CD44+CD24-/low, CD44+CD24-/lowLin-B38.1+ESA+乳腺癌中以CD44+CD24-/low为分子标志物的细胞为乳腺癌干细胞（breast cancer initiating cells，BRCa IC）。Clarke等［2］首次从人类乳腺癌标本中分离出BRCa IC，并把表达CD44、B38.1和ESA的乳腺癌细胞移植到NOD/scid小鼠体内并生成肿瘤。Al-Hajj等［3］以Lin-ESA+CD44+CD24-/low为特异性乳腺癌干细胞，证明了表型为Lin-ESA+CD44+CD24-/low的细胞较表型为Lin-ESA-CD44+CD24+的细胞在NOD/scid小鼠体内具有更强的成瘤能力。Ponti等［4］把乳腺癌组织和乳腺癌的细胞系中分离出的CD4+CD24-CD43-进行体外培养，结果显示细胞呈球状生长，并过表达血管生成因子、细胞保护因子及公认的干细胞标志物Oct4。但Abraham等［5］用免疫双染法检测了136例患者石蜡组织切片，发现CD44+CD24-/low的比例与临床结果无关，CD44+CD24-/low比例高的乳腺癌更倾向于骨转移，提示对BRCa IC的标志尚需进一步细化及深入研究。

2.2 Wnt、Notch和Hedgehog等信号通路分子 有证据表明与乳腺癌形成有关的信号通路，如Notch、Shh和Wnt、Hedgehog参与了调整乳腺癌干细胞自我更新的过程。乳腺干细胞高表达Notch1、Notch4及其靶基因HESR-1［6］，Notch通路的活化导致了乳腺微球体的形成，却对分化细胞无作用［7］。Wnt蛋白是细胞间的信号分子，正常情况下，该分子调节一些器官的发育，其异常调节时则导致肿瘤发生。研究表明，Wnt信号通路的活化可引起乳腺癌干细胞的比例增加［8-9］，骨髓中Wnt表达可能同样影响 HSCs，使用高度纯化的小鼠骨髓HSCs。在长期的HSCs培养中，激活β-catenin的过度表达（一种Wnt的下游激活物）能扩增可移植的HSCs［10-12］。Liu等［13］研究发现，Hedgehog在乳腺癌干细胞高度表达，其通道活化后乳腺微球体数量及体积均增加，同样提示Hedgehog异常表达可导致乳腺癌的形成。

2.3 乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH） ALDH1是细胞内乙醛氧化脱氢酶，可在干细胞分化早期氧化视黄醇而形成视黄酸，鼠和人类的造血及神经干细胞中ALDH1活性较高［14-15］，Hoechst染色法和ALDH活性已被用来纯化和鉴定鼠和人的造血干细胞［16-17］。此外，循环祖细胞也可用ALDH活性来鉴定［18］。另一研究显示ALDH1的表达可能提示乳腺上皮细胞具有干细胞特征。Ginestier等［19］发现ALDH1活性增加的正常人和癌症患者的乳腺上皮细胞具有干/祖细胞特性。含有高水平的ALDH1的正常乳腺上皮细胞群能形成乳腺球，从中分离的细胞能自我更新。ALDH1高活性的乳腺癌细胞可以重现亲代肿瘤的杂合性，表明ALDH1高活性的乳腺癌细胞也包含干细胞群。Ginestier等［19］还认为ALDH1免疫组织化学检测可用来鉴别乳腺干细胞。ALDH1阳性细胞定位于末端导管小叶单位。另一研究认为乳腺癌干细胞定位于乳腺导管［20］。在乳腺癌临床检测中ALDH1的表达与预后有关。

3 乳腺癌干细胞的分离鉴定

3.1 乳腺癌干细胞的分离 乳腺癌干细胞的成功分离是为下一步进行乳腺癌干细胞特性研究的关键步骤。研究者采用各种不同途径来分离乳腺癌干细胞，每种方法各有其利弊。目前比较成熟的方法有2种：流式分选法（fluorescence-activated cell sorting，FACS）和磁式分选法（magnetic activated cell sorting，MACS）。

3.1.1 FACS

3.1.1.1 利用干细胞通用分子标记ABCG2进行分选 三磷酸腺苷结合盒转运体（ATP-binding cassette super family G member 2，ABCG2），基因在多种来源的干细胞膜均有表达，而在大多数成熟细胞中不表达。在乳腺癌干细胞中同样高表达ABCG2，其高表达细胞高效外排DNA荧光染料Hoechst33342，从而能用流式分选出侧群（side population，SP）干细胞。Patrawala等［21］利用此法成功分离出乳腺癌干细胞。

3.1.1.2 利用干细胞表面一些膜蛋白来分选 乳腺癌干细胞可利用CD44和CD24［4］分子来分选，Li等［22］采用悬浮培养结合化疗药物分类的方法分离能产生新肿瘤的单个乳腺癌干细胞，将TMD40小鼠乳腺癌细胞在无血清培养液中培养，通过流式细胞仪测试CD44和CD24的表达，用抗癌剂紫杉醇和多柔比星处理细胞，快速杀死处于分裂期的癌细胞，留下相对静止的乳腺癌干细胞。

3.1.1.3 利用乳腺癌干细胞中ALDH的含量较高的特性进行分选 ALDH是存在于细胞液中的一种氧化还原酶，主要对细胞内的醛进行氧化，在乙醇和维生素A的氧化及环磷酰胺耐药中均有重要作用。

最近有研究中发现，高ALDH活性的正常乳腺上皮细胞具有干细胞的特性，可在NOD/scid小鼠体内形成乳球和导管小叶结构［23］。在人类乳腺癌的异种移植中，ALDH+的细胞也具有肿瘤干细胞的特征：约占细胞总数的1%～10%，致瘤性很强，200个ALDH+的细胞即可在NOD/scid小鼠体内形成肿瘤，且新形成的转移瘤中具有与原发肿瘤相同的ALDH基因表达图谱，但2×103个ALDH-细胞也不能形成转移瘤。此外，利用肿瘤组织的微阵列分析也发现ALDH+的乳腺癌临床预后差。目前临床上使用测定ALDH的活性为乳腺癌的早期发现提供有力支持。

3.1.2 MACS磁珠系统 MACS利用未标记的CD分子的单克隆抗体作为一抗与单细胞悬液温育后，再与免疫磁珠标记的二抗结合，当这种特异性一抗、二抗标记的细胞悬液流过特制的永久磁铁的磁场时，可吸附在磁式分选柱内，再将磁式分选柱移开磁场并从柱内洗脱，从而收集干细胞。

3.2 乳腺癌干细胞的鉴定 当前，从形态学方面对乳腺癌干细胞进行鉴定较为困难，只能从功能学方面进行分析。

3.2.1 利用肿乳腺癌干细胞的生物学特性在体外培养进行初步的鉴定 即体外培养的乳腺癌干细胞是否呈悬浮球状生长，是否具有自我更新和增殖能力以及是否具多向分化潜能。目前有研究［24］表明：乳腺癌干细胞易呈悬浮球状生长并可连续传代，在传代的后期更易出现悬浮球状生长且增殖速度加快；此外，通过有限稀释实验和亚克隆培养分析发现所有亲本肿瘤球制成的细胞悬液都再次形成肿瘤球，且与亲本肿瘤球完全相同，提示乳腺癌干细胞具有自我更新和增殖能力；将乳腺癌干细胞转移至含血清的培养液中培养7 d左右，便不再或极少表达Nestin和CD133，而这2种标记物现在普遍被认为在干细胞或是祖细胞中表达，表明了干细胞具有多向分化的潜能。但这些方法只能初步鉴定乳腺癌干细胞。

3.2.2 测定体外克隆形成能力鉴定乳腺癌干细胞 即将初步鉴定出的乳腺癌干细胞在NOD/scid小鼠体内重建模型，从而观察其致瘤性，此种方法被认为是目前进行肿瘤干细胞鉴定的最具说服力的方法。

3.2.3 鉴定乳腺癌干细胞的新方法—应用ALDEFLUOR试剂检测 美国密歇根大学综合癌症中心的研究人员最近又发现一种鉴定乳腺肿瘤干细胞新方法［25］，这项发现不仅为确定乳腺癌治疗最佳方案提供了一种简单诊断方法，还强有力地支持了癌症干细胞学说。研究人员利用名为ALDEFLUOR的试剂来检测细胞中的ALDH活性。表达高水平ALDH的细胞会发出荧光并且能够被检测到。随后，细胞被分选并与被染色细胞分离。在此过程中，研究人员发现ALDEFLUOR试剂检测阳性细胞的行为与干细胞相同，而检测结果为阴性细胞则明显不同。

4 乳腺癌干细胞在乳腺癌治疗中的应用 现有的乳腺癌治疗方法多旨在尽可能杀死或清除一切肿瘤细胞［26］。但是对存在于肿瘤中的数量稀少的干细胞样细胞群却作用甚微，治疗后残存肿瘤干细胞的增殖，足以促使肿瘤复发和转移。

乳腺癌复发被认为是由于非分裂的乳腺癌干细胞具有抗药性。比如，大多数与BRCA21基因相关的乳腺癌在解除铂类化疗药物治疗2～3个月后获得抗铂性［27］。对这些肿瘤细胞分析发现，与原发性肿瘤移植相比，CD29highCD-24med细胞群在铂类药物难治性继发肿瘤移植中显著增加，从6.6%～11.0%增加至16.5%～29.2%。这表明克隆演变和乳腺癌干细胞扩增可能是化疗耐药的一个原因。免疫疗法是另一种用来消除乳腺癌干细胞群的治疗方法［28］。

Li等［29］研究显示添加突变rh471 TNF2α到MCF7亚群(乳腺癌干细胞标记阳性)可促进细胞凋亡和降低自我更新的能力。突变rh471 TNF2α可负性调节乳腺癌干细胞，也有可能被应用于乳腺癌治疗。Piyush等［30］发现盐霉素杀死乳腺癌干细胞的能力比普通的化疗药物如紫杉醇强100倍。与被紫杉醇处理过的肿瘤干细胞相比，经过盐霉素处理过的肿瘤干细胞被注入到实验鼠体内后，成瘤几率显著降低，且实验鼠肿瘤的生长速度也明显减慢。

5 展望 总之，乳腺癌干细胞理论为根治乳腺癌开辟了新的治疗途径，肿瘤治疗研究开始以特异性乳腺癌干细胞为主要目标，即从源头上根治肿瘤。发现和阐明乳腺癌干细胞增殖过程中的基因调控机理，将为抗肿瘤药物的研发提供新的靶点，针对乳腺癌干细胞的新一代特异性强的抗肿瘤生物及免疫药物有望极大地提高肿瘤的治疗效果。

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