耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因的研究进展

王凤玲, 侯英荣, 冯秀河

金葡菌是临床最常见的病原菌之一,在临床分离菌中分离率位居前列,其中以MRSA临床意义尤为重要。由于其多重耐药性和易造成医院感染的暴发流行,已成为临床抗感染治疗的一大难题[1]。金葡菌可引起一系列的化脓性感染、食物中毒及中毒性休克综合征等,其化脓性感染从小的皮肤感染病变如疖、痈到严重的感染如组织坏死、坏死性肺炎、骨髓炎和心内膜炎等。其释放的毒素可引起全身非特异性炎症反应,并导致难以控制的败血症,严重者造成多器官功能障碍甚至死亡。携带毒素因子[如Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)、中毒性休克素I(TSST-I)、金葡菌肠毒素(SE)]的金葡菌毒力更强,与感染后疾病的严重程度相关。MRSA对抗生素的耐药性日趋严重且对多种抗生素耐药,因此MRSA引起的医院感染一旦发生,常难以控制。本文对MRSA耐药基因及致病毒素基因等作综述。

一、MRSA耐药基因

MRSA对β内酰胺类的耐药性系由mecA基因决定,此基因负责编码青霉素结合蛋白PBP2a(PBP2a),该蛋白是一种酶,与β内酰胺类抗生素的亲和力很低,但其生理功能与细菌本身固有的PBPS相同。PBPS介导细菌细胞壁合成过程中肽聚糖的交联,对细菌生长繁殖、保持正常形态起重要的作用。PBPS是β内酰胺类抗生素与细菌结合的靶位,与抗生素有高度的亲和力,β内酰胺类抗生素与PBPs共价结合后使其失去酶活性,使细菌细胞壁合成障碍而导致细菌死亡。PBP2a起了PBPS功能,使细菌细胞壁合成不受影响,维持其细菌的存活并生长,使MRSA表现出耐药性[2]。MecA是MRSA耐药的决定因子,是金葡菌环状染色体上一个外来的大小为30～50 kb的插入片段,mecA基因位于葡萄球菌染色体mec盒(Staphylocossal cassette chromosome mec,SCCmec)上,SCCmec包括mec基因复合体和负责移动的染色体重组基因ccr。

mec基因复合体由结构基因mecA和位于其上游的调节基因mec R1和抑制基因mec I组成,三者控制着MRSA耐药性的表达程度,其中mecA编码PBP2a,mecI编码的抑制因子(MECⅠ蛋白)结合在mecA基因的启动子部位,使mecA基因不能被转录;mecR1在诱导剂(如β内酰胺类抗生素)的作用下编码产生诱导因子 (MECR1蛋白),能够去除MECI蛋白对mecA的阻遏作用,使mecA转录产生PBP2a[3]。mec A基因的表达还受BlaR1和BlaI基因的调节,研究表明两者与mecR1和mecI基因有高度的同源性。Mec复合体分为4种即classA：mecI-mecR1-mecA、 classB： △ISI1272-mecR1-mecA 、classC：IS431L-△mecR1-mecA,其中 C1、C2的 IS431L方向相反、classD：△mecR1-mecA。

染色体盒重组基因复合体(cassette chromosome recombinases,ccr)由2种位点特异性重组基因(ccrA和ccrB)与其相邻的orf s组成,位于SCC-mec的近中部,ccrA、ccrB基因编码的重组酶对于SCCmec的可移动性起重要的作用,ccr分为4种(ccrAB1 、ccrAB2、ccrAB3 和 ccrC),根据 mec复合体和ccr的不同组合,可将SCCmec分为6型[4],即Ⅰ型 class B mec+type 1 ccr、Ⅱ型 class A mec+type 2 ccr、Ⅲ型 class A mec+type 3 ccr、Ⅳ型class B mec+type 2 ccr、Ⅴ型class C2 mec+type 5 ccr和Ⅵ型classβmec+type 4 ccr,其中Ⅱ、Ⅲ型是医院感染MRSA的常见类型,Ⅳ、Ⅴ型社区感染的常见类型。

研究表明PBP2a产量与MRSA耐药水平的高低及MIC值并无相关性,PBP2a产量相同的MRSA的MIC值可相差很大,这提示除了mecA基因外还有其他耐药基因。femA、f emB、f emC、f emd、femE和f emF是金葡菌染色体上的固有基因,与甲氧西林的耐药表达有关,这些辅助基因与mecA基因的协调作用产生对β内酰胺类抗生素的高度耐药性,这是由染色体介导的固有耐药。HmrC、hmeD、chr基因是染色体突变基因,引起金葡菌对甲氧西林的高度耐药,其机制尚未明确。另外mecA基因的表达还受环境因素如pH、湿度、2价金属离子及生长温度的影响。

20世纪90年代初已开始报道应用PCR检测mecA基因,近年来许多国家已成功检测到mecA基因并应用于临床。PCR法检测MRSA具有较高的灵敏度和特异度,操作简单、准确、快捷,结果直观。按照NCCLS 2004年版建议,凡检测出mecA基因或PBP2a即可确定为MRSA。由于抗生素种类不断增加及临床上应用不尽合理,MRSA引起的感染呈逐年上升趋势,且MRSA多重耐药性日趋严重,所引起的全身感染的病死率高达50%以上。文献报道1993年日本Cansai医科大学附属医院MRSA分离率为 41.0%,1999年英国30个监测中心MRSA检出率高达56.7%,1999年美国疾病控制中心(CDC)统计全美重症监护病房内感染患者MRSA阳性率占 53.2%。我国MRSA的感染率也相当高,1997年我国台湾临床上MRSA的检出率占70.7%,1998年上海地区的MRSA分离率为70.7%,1997年北京检出率为52.9%,提示MRSA引起的感染已非常普遍。

二、PVL及PVL基因

PVL是金葡菌产生的细胞外毒素,PVL、γ溶血素和其他杀白细胞素均属于synergohymenotropic毒素家族。PVL由两种蛋白质组成,即S和F蛋白(LukS-PVT LukF-PV),其分子量分别为34 ku和33 ku,两种组分各有不同的生物活性和功能,对人体的多形核白细胞(PMNs)和巨噬细胞具有高度的特异性,F蛋白和S蛋白之间有36%的氨基酸序列同源性。PVL属于膜钻孔毒素家族,Lusk-PV首先与PMNs细胞膜上的特异性高亲和力强的受体结合,LukF-PV再与之结合形成二聚体,然后依次Luks-PV和LukF-PV结合最后形成环状结构的杂聚体。此环状结构内径3 nm,外径9 nm,分子量大约为200 ku,其中所含Luks-PV和LukF-PV的克分子比为1∶1,此杂聚体插入到PMNs细胞膜上,形成一个大约直径2 nm的穿膜孔,此孔与细胞膜的平面垂直[5]。PVL通过诱导PMNs坏死或凋亡使细胞死亡,这依赖于PVL的浓度。在低浓度时,PVL特异地与尚未明确的细胞表面受体结合,产生较多的杂聚体孔道,有利于其他的PVL分子进入细胞,在线粒体外膜上建立孔道,破坏线粒体的内环境,激活caspase-9和caspase-3,释放杀白细胞素C,诱导细胞凋亡[6]。而在高浓度时,PVL可能非特异地吸附到脂质双层上,形成较大的八聚体孔道,当Lusk-PV与PMNs结合时,蛋白激酶A或C磷酸化Lusk-PV,激活Ca2+通道,Ca2+内流而产生白细胞介素和炎性介质,使PMNs溶解,释放出氧化代谢产物和炎性介质引发一系列炎症反应,严重者造成组织坏死。

PVL是由2个基因编码,即 Luks-PV基因和LukF-PV基因,现已发现一些葡萄球菌噬菌体上有PVL基因,这些噬菌体可特异地插入到金葡菌染色体上,该位点与SCCmec插入位点不同,业已表明,PVL基因能为金葡菌提供SCCmec插入、生存所必需的适合结构,PVL基因可通过噬菌体转导在细菌中传播。约2%的医院感染MRSA菌株携带 PVL基因[7],而大约3/4的社区MRSA(CA-MRSA)分离株携带PVL基因。

产PVL的金葡菌毒力非常强,常与皮肤、软组织化脓性感染相关,特别是蜂窝组织炎、脓肿和疖肿等疾病,从这些疾病患者获取的金葡菌PVL阳性率达50%～93%,引起甲沟炎的金葡球菌中PVL阳性率为13%。严重者可导致组织坏死和坏死性肺炎,而坏死性肺炎常暴发性起病,病死率很高。据报道,2005年12月英国由产PVL的MRSA引起的坏死性肺炎致使2例患者死亡。PVL阳性金葡菌感染者(平均年龄14.8岁)比PVL阴性感染者(平均年龄70岁)更年轻。Diep等[8]研究显示,总共收集的671株金葡菌中,PVL阳性率为33.5%(225/671),其中约有1/3医院感染 MRSA菌株和 2/3 CA-MRSA菌株的PVL阳性,而相应的MSSA菌株中的PVL阳性率却低于7%。余方友等[9]研究显示,195株金葡菌中PVL阳性率为13.3%,其中121株MRSA中 PVL基因阳性率为15.7%(19/121),74株MSSA中的PVL基因阳性率为9.3%(7/74)。许多研究结果表明MRSA菌株中PVL阳性率高于MSSA。目前MRSA耐药性日趋严重且呈现多重耐药现象,加之大多数患者具有基础疾病,机体免疫力降低,若再感染了毒力强的产PVL的MRSA,其预后更加不良。由于MSSA的耐药性不严重,所引起的感染往往被临床忽视,可能会造成不良后果。

三、TSST-Ⅰ及 TSST-Ⅰ基因

金葡菌引起人类各种疾病,其中中毒性休克综合征(toxic shock syndrome,TSS)因多器官受累,病死率高而备受重视。TSST-Ⅰ是由噬菌体Ⅰ群MSSA产生的外毒素,是一种多肽蛋白质,属于致热原性超抗原家族,它的超抗原活性很强,而分子量很小,约22 ku,DNA序列有708对碱基,585对碱基编码194个氨基酸残基,等电点为7.2。TSST-Ⅰ和金葡菌肠毒素A有34%氨基酸同源。TSST-Ⅰ具有2个亚单位(A、B)多肽链结构,其A 亚单位是毒素的活性中心,决定毒素的致病性与作用方式,多具酶的活性,通过作用于细胞内的靶点而发挥细胞毒效应,B单位能与靶细胞上的特异性受体结合,它决定毒素对宿主细胞的选择亲和性。TSST-Ⅰ不经抗原提呈细胞处理,而是以完整蛋白质的分子直接结合到细胞表面主要组织相容性复合物Ⅱ(MHCⅡ)类分子抗原结合槽的外侧,形成的复合物与 T淋巴细胞抗原受体(TCR)的β链V区结合,经磷酯酰肌二醇二磷酸和环磷酸鸟苷信号传导途径激活T淋巴细胞使其活化、增殖,并释放大量的炎性细胞因子如 IL-1、IL-2 、INF-γ、TNFα、TNFβ等引起强烈的免疫应答,最终导致炎症失控和多器官的损害。由于TCR的β链V区仅存在有限的基因,核苷酸序列非常保守,同一个体内的许多T淋巴细胞可具有相同的β链V区成分,因此极低浓度TSST-Ⅰ即可激活大量的T淋巴细胞(可达全部T淋巴细胞的53%～0),而常规抗原只激活0.01%～0.1%的淋巴细胞[10]。TSST-Ⅰ还能直接损害库普弗细胞,抑制内毒素脱颗粒反应,使内毒素在体内蓄积;扩大内毒素的致死效应105～106倍,2 μ g的内毒素进入人体可引起内毒素休克,而在TSS患者仅需10-12g水平的内毒素即可发生严重的低血压和休克,这称之为级联效应;TSST-Ⅰ还可增加血管透性,抑制B淋巴细胞,减少特异性抗体产生等途径介导休克。

TSST-Ⅰ由 TSST-Ⅰ基因编码,位于细菌染色体上,全长 702 bp,编码 234个氨基酸,当金葡菌携带的 TSST-Ⅰ基因被激活时,即产生 TSST-Ⅰ毒素,该基因仅存在于5%～15%的金葡菌的菌株之中,其他在人体内无害生存的菌株不具有 TSST-Ⅰ基因,该基因由一个被称为附属基因调节器的整体系统来控制,该系统控制很多分泌蛋白的产生,而某种蛋白在其细胞外浓度达到一定水平时触发TSST-Ⅰ基因活性,这就是TSST-Ⅰ毒素的产生受细菌密度影响的原因。

TSST-Ⅰ可引起机体发热、脱屑性皮疹及休克,并增加对内毒素的敏感性,感染产毒菌株后可引起机体多个器官系统的功能紊乱或 TSS病,病死率高。20世纪80年代早期TSS多见于月经期使用卫生棉塞或卫生栓的妇女中,因而提名为月经相关性TSS。现在TSS不仅在年轻月经期妇女中发生,而且非月经期的妇女、男性及儿童也可发病。Recsei[11]等首先发现了非月经性TSS即流行性感冒相关性TSS,所致感染虽然轻微,无明显发热,但在儿童中死亡率极高可达90%。20世纪80年代以后的文献报道,烧伤、鼻部手术后、脓肿、皮肤移植、外科手术发生感染后也能并发TSS。王慎[12]等对20例具有典型新生儿出疹病的患儿观察研究,发现患儿体内均有MRSA寄殖,并且都产生TSST-Ⅰ,但临床症状与TSS不符,因此命名为新生儿中毒性休克综合征样出疹病。国外曾有人报道,临床MRSA感染菌株中约50%伴有肠毒素和(或)TSST-Ⅰ产生,其中绝大多数为耐药菌株。王敏等[13]研究显示,共收集的84株金葡菌中,TSS T-Ⅰ基因阳性率为19.05%(16/84)。祁伟等[14]研究结果显示,总共收集的112株 MSSA中 TSST-Ⅰ基因阳性率为20.5%(23/112),MSSA TSS T-Ⅰ基因阳性与TSST-Ⅰ表达两者之间的一致性大于99%。不仅引起TSS的金葡菌产TSST-Ⅰ,而且引起其他疾病的金葡菌株也能产TSST-Ⅰ,这些产TSST-Ⅰ的金葡菌株无疑对患者特别是对那些免疫功能缺陷不能产生特异性抗体者构成了潜在的威胁。

目前MRSA耐药性日趋严重且呈现多重耐药现象,加之大多数患者具有基础疾病,机体免疫力降低,若再感染了毒力强的产 PVL和 TSST-Ⅰ的MRSA,增加了临床治疗的难度,其预后更加不良;金葡菌的耐药性相对不严重,所引起的感染往往被临床忽视,可能会造成不良后果。

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