牛AMPK家族基因的研究进展

石秀英,房兴堂,张春雷,陈 宏＊,2

(1.徐州师范大学生命科学学院,细胞与分子生物学研究所,江苏徐州221116;2.西北农林科技大学动物科技学院,陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西杨凌712100)

1973年,Berg和Carlson等报道了一个与羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶相关的蛋白激酶,随后的研究表明,其活性受AMP(一磷酸腺苷)的调节,故称为AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)[1]。AMPK在真核细胞生物中广泛存在,能感知细胞能量代谢状态的改变,并通过影响细胞物质代谢的多个环节维持细胞能量供求平衡。近年来研究发现,AMPK在下丘脑摄食调控中起作用,激活 AMPK促进摄食,抑制 AMPK引起厌食[2,3]。

1 AMPK的结构

1.1 AMPK的结构及分布

AMPK作为能量调节器的最重要特征是它对细胞内能量状态的高敏感性,而这种性质是由它独特的生化结构决定的。1998年 Hardie等总结了AMPK的分子结构[4]。AMPK是一个异源三聚体蛋白,由催化亚单位α和调节亚单位β、γ构成,每个亚单位都是AMPK的活性所必需的。α和β亚单位各由两个基因编码(α1,α2和β1,β2),而γ亚单位则由三个基因编码(γ1,γ2和γ3)。α亚单位的N末端是起催化作用的核心部位,含有一个典型的丝/苏氨酸蛋白激酶的催化区域,C末端则主要负责活性的调节以及联系β和γ亚单位[5]。α1由548个氨基酸组成,其中Thr172是一磷酸腺苷激活蛋白激酶的激酶(AMPKK)磷酸化位点,它是AMPK活性的关键;α2由554个氨基酸组成。α1在哺乳动物组织中分布较为广泛,α2主要分布在骨骼肌、心脏和肝脏中[6]。β亚单位则好似一个支架,它可把α和γ亚单位连接起来[7]。β亚单位包含两个保守区域,分别位于中心和C端,β亚单位C末端的保守结构域是形成三聚体的关键,是与α和γ亚单位结合的区域;而N末端含有N-异淀粉酶区域,称作糖原结合域,其功能可能与糖原对AMPK的调节有关。β1具有广泛的组织分布性,而β2主要分布在骨骼肌、心脏和胰腺中[8]。γ亚单位有4个串行重复的CBS(胱硫醚-β-合成酶 ,cystathionine-beta-synthase)区域,每个串联重复序列由60个氨基酸构成,被命名为CBS模序,每一对CBS结构域可以形成一个有功能的Bateman域,可以结合一分子的AMP[9,10]。γ1和γ2分布较广,而γ3只特异性地在骨骼肌中表达。

1.2 牛AMPK家族基因结构特征

McKay等对牛5′AMPK基因家族7个基因进行了研究,他们是 PRK AA1、PRK AA2、PRKAB1、PRK AB 2、PRK AG1、PRKAG2和PRKAG3,并初步将其分别定位于牛 20、3、17 、3、5 、4和2号染色体上[11]。牛PRKAB1共有7个外显子,编码的氨基酸全长为496个。Sazanov等用荧光原位杂交(FISH)分析将牛PRKAG1基因定位于5q21-q22上[12]。后来McKay等用全基因组辐射杂交图谱证实了这一结论,Benkel等确定了牛PRKAG1基因的结构,其序列包括12个外显子和11个内含子[13]。各物种的PRKAG3基因序列都包含13个外显子和12个内含子[14]。Yu等运用韩国牛BAN文库,确定了牛PRKAG3基因的结构和序列,PRKAG3基因包括13个外显子,总长度约有 6.8 kb,编码的氨基酸全长为465个,用Northern杂交分析证明牛与其他物种相似,且牛的PRKAG3基因也只在骨骼肌中表达[15]。Roux等分析了3个品种牛的PRKAG3基因序列及蛋白质序列,确定了牛PRKAG3基因包括13个编码外显子,和一个3'非编码外显子,在猪中影响肉质的突变位点在牛中突变频率较低[16]。因而初步推断牛PRKAG3基因也可能与肉质有关。

2 AMPK的功能

2.1 AMPK活性的调节

AMPK的活性主要受细胞中AMP/ATP比值的调节。此外,AMPK的活性也受酶的调节,目前已经发现AMPK的上游激酶有两种:肿瘤抑制蛋白LKB和两个附属亚单位STRAD和MO25形成的复合体;钙调蛋白依赖蛋白激酶激酶(CaMKK)。下游激酶已发现达数十种。人工合成的激动剂也能够使AMPK活化,目前研究最为广泛和深入的是5-氨基-4-甲酰氨咪唑核糖核苷酸(AICAR)。然而AICAR并非AMPK的特异性激动剂。AICAR是一种腺苷类似物,能够被细胞摄取,在腺苷激酶的磷酸化作用下形成一磷酸衍生物5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷(ZMP),具有AMP样作用,而ZMP也能够影响其他AMP调节的酶(磷酸酯酶,果糖-1,6-二磷酸酶)的活性。尽管AMP/ATP比值升高是激活AMPK的经典途径,但许多激素、细胞因子都参与了AMPK信号途径,如瘦素、抵抗素、脂联素、二甲双胍和罗格列酮等也可激活AMPK。瘦素是由脂肪细胞分泌的激素,在调节脂肪酸氧化、葡萄糖摄取及阻止脂质在非脂肪组织聚积中起重要作用,有研究表明瘦素可能是通过AMPK对代谢起调节作用的。脂联素是一种对抗糖尿病胰岛素抵抗的激素,来自脂肪细胞,具有调节能量代谢、葡萄糖和脂肪代谢的作用。

2.2 AMPK对物质代谢的调节

在哺乳动物中,AMPK的活性与细胞能量水平密切相关。AMP/ATP比率的增加,能促使AMPK得到激活。AMPK被激活则ATP消耗的途径将被关闭,而ATP生成的途径将被开启。近来的研究表明,AMPK可能在更大范围内对全身的能量代谢起重要的调节作用。

2.2.1 AMPK对脂质代谢的作用 AMPK激活后不仅能增加脂肪酸氧化,而且还有抑制脂肪合成的作用。AMPK 活化使β-羟基-β-甲基-戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)以及甘油磷酸酰基转移酶(GPAT)磷酸化失活,从而抑制胆固醇和脂肪酸的合成[17,18]。AMPK对脂质的另一调节途径表现在对激素敏感脂酶(HSL)的作用上。

2.2.2 AMPK对糖代谢的作用 AMPK调节葡萄糖摄取可能通过两种方式起作用:促进葡萄糖转运体转位和葡萄糖转运子(GLUT)表达增加[19]。Halse在对离体骨骼肌细胞的研究中发现 AMPK不仅促使葡萄糖摄取,还抑制糖原的合成,从而促进葡萄糖向糖酵解方向转化。大量研究结果表明,用不同方法活化AMPK可以增加肌细胞对葡萄糖的摄取,其机制可能是由于激活葡萄糖转运体GLUT1和GLUT4所致。AMPK的激活引起糖酵解的限速酶-磷酸果糖-2-激酶(PFK2)磷酸化,刺激2,6-二磷酸果糖产生,从而促进糖酵解产生更多ATP。此外,AMPK的活化还能减少糖异生酶(如1,6-二磷酸果糖激酶、烯醇化酶)的表达,抑制糖异生,以及通过磷酸化糖原合成酶(GS)抑制糖原的合成[20]。

2.2.3 AMPK对蛋白质代谢的作用 AMPK对蛋白质合成代谢的抑制作用体现在对真核延长因子(eEF-2)激酶和哺乳动物的雷帕霉素靶体(mTOR)的作用上。eEF-2是蛋白质合成中肽链延伸所必需,可调节蛋白的转录,参与肽链的延长,其活性可被eEF-2激酶通过磷酸化而抑制。而AMPK可能通过激活eEF-2激酶,使eEF-2磷酸化失活,导致蛋白质合成受到抑制。mTOR作为胞浆内的激酶,是蛋白质翻译中的重要调节物,生长因子可激活它,而营养撤除可抑制其介导的信号通路。有研究表明,AMPK和mTOR信号通路相关联,活化的AMPK通过抑制mTOR及其效应器的活性,并增加eEF2的磷酸化,从而抑制蛋白质合成[21]。

2.2.4 对胆固醇合成的调节 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶是胆固醇合成的关键酶。ATP减少时,AMPK激活使HMG-CoA还原酶的ser871位磷酸化而失活,因而胆固醇合成减少。有报道称细胞与纤维粘连蛋白(Fn)分离后激活AMPK,HMG-CoA还原酶受抑制,使细胞膜胆固醇合成减少,Fn附着细胞则相反[22]。

2.2.5 AMPK与动物应激情况下动物代谢的关系AMPK在动物应激(生理、营养、环境和疾病等)过程中起着重要作用[23]。动物生产过程中,机体常遭受到来自外环境和生理因素的多种应激,而不管是外界应激还是自身应激因素,都会给机体造成重大的影响,轻者造成采食量下降,生产性能降低,重者导致死亡。虽然目前仍缺乏这方面的试验证据,但可以推断AMPK在该过程中发挥着重要的调节作用。应激条件下,AMPK被激活,抑制机体合成代谢,促进分解代谢,从而导致生长速率下降甚至失重。根据AMPK存在的广泛性、进化的保守性和功能的专一性,不难假设,AMPK也与家畜应激的调节有关。高产奶牛的酮病,可能与应激使AMPK的活化有关。

3 牛AMPK家族基因的研究现状

3.1 AMPK家族基因遗传多态性的研究

Zhang等在4个牛品种PRKAB1基因7个外显子及外显子-内含子区发现29个单核苷酸多态性(SNPs):4个位于5'-UTR;8个位于编码区,包括1个无义突变,1个错义突变,6个同义突变;17个位于内含子区。此外在启动子区发现了 12个SNPs和一个 10 bp的插入和一个 4 bp的缺失[24,25]。Benkel等在三个优秀的肉牛品种中,检测了PRKAG1基因外显子9到11的序列,在内含子10中发现4个SNPs[13]。Yu等在PRKAG3基因四个牛品种中发现7个SNPs。Roux等在3个牛品种中共发现了PRKAG3基因的32个SNPs,其中13个位于编码区,1个位于3'非翻译区,18个位于内含子中。5个导致了氨基酸的改变,且位于编码区等位基因突变的频率较低。在该基因的两个位置上发现了可变剪切位点,导致了群体中出现异种蛋白[26]。McKay等利用混合测序法在牛PRKAG3外显子2中发现2个突变其中1个同义突变和1个无义突变。

3.2 AMPK家族基因在其他方面的研究

Zhang等关于AMPK家族基因不同物种间密码子使用频率的研究显示,基因的功能是决定密码子使用偏好性的优势因子,而物种差别只是很小的因素[27]。Benkel等的研究表明牛AMPKγ1蛋白编码区其核苷酸序列与人和鼠的同源性分别为93%和90%,而牛AMPKγ1蛋白的氨基酸序列与人和鼠的一致性分别为98%和95%[11]。Roux等的研究结果表明牛AMPKγ3蛋白与人、猪和鼠的一致性分别为84%、83%和81%[26]。

4 AMPK家族基因的应用前景

AMPK广泛存在于真核细胞中,哺乳动物的AMPK属于高度保守的蛋白激酶家族,它是蛋白激酶级联系统中的中心元件,在调节能量代谢的信号转导机制中起着枢纽作用。AMPK在功能上的特点及进化上的保守性,说明该酶系在生物的遗传与进化过程中起重要作用,有研究显示在其他物种上的一些突变,可以改变AMPK的信号传导和多个代谢途径,也可推断其在牛上亦有相同的作用,通过对其代谢的影响进一步影响其生长状况;应激条件下,AMPK被激活,机体合成代谢受抑制,分解代谢加快,从而生长速率下降甚至失重;该基因在其他物种上与疾病的相关性,也可以认定为是牛抵抗疾病的候选基因;AMPK在下丘脑摄食调控中起作用,激活AMPK促进摄食,抑制AMPK引起厌食,从这一研究结果可以推测AMPK的突变也可能会对牛的体重产生影响。此外,人工激活剂AICAR可以通过激活AMPK进而对牛卵母细胞的核成熟有抑制作用[28],这一结果可以较好的为牛业同期发情处理提供理论资料。随着对AMPK研究的日趋深入,人们对AMPK的功能已经有很多方面的了解。在牛上对该基因的研究及其对功能的验证,可以促进其对生产的指导作用,进一步为动物的遗传育种提供理论依据。当然,目前阶段的研究尚不成熟,还需要进行进一步的研究,尤其是与生产性能相关的研究报道很少。

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