BM Y牛细管冷冻精液生产工艺及稀释液的筛选

赵家才,毛翔光,马燕茹,张海潇,何永富,杨国荣,黄必志＊

(1.云南省家畜冷冻精液站,云南 昆明 小哨 650212;2.云南省草地动物科学研究院,云南 昆明 小哨 650212)

我们从2002年至今,开展了BMY牛细管冷冻精液及其生产工艺的试验研究,并获得了较理想的效果。

1 材料和方法

1.1 试验BMY牛精液的来源和采精方法

供试的BMY牛精液为云南草地动物科学研究院通过云南黄牛为母本,用墨累灰牛为第一父本进行杂交,再用婆罗门牛为第二父本与二元杂交母牛杂交,然后利用三元杂交群体横交培育的 BMY牛[1],在全放牧条件下用电刺激法采集的新鲜精液。

Research progress of biomass phenolic-based surfactants 11 34

1.2 牛精液冷冻稀释液的种类、必备的条件和稀释的目的

牛精液冷冻稀释液主要有柠檬酸盐——糖类稀释液,奶类稀释液,乳糖类稀释液,三基类稀释液和TES类稀释液等。排出体外的精子,在外界变化的环境中(如温度等)精清对其保护性是有限的,特别是冷冻解冻的急剧变化。为此进行牛精液冷冻保存就要配合使用专门的溶液先把精液进行稀释等技术处理。牛精液冷冻稀释液要适于精子生存,能保护精子膜的完整性,能抑制对精子有害的物质。牛精液的稀释是在精液中加入适于精子生存并保持正常授精能力的稀释液。稀释的目的主要是增加精液数量,提高种公牛的利用率,降低精液能量消耗,补充适当营养和保护物质的活动延长精子的寿命,有利于精子的冷冻和保存[2]。

1.3 牛精液冷冻稀释液配制、筛选和稀释方法

1.3.1 牛冷冻稀释液的配制 以浓度为0.2 mol/L,pH为6.5,含1%果糖的三羟甲基氨基甲烷(T ris)缓冲液,其中抗菌物质的添加采用美国国家动物育种协会和商业化的精液处理者所采用的微生物控制方案:每毫升原精液(未稀释的)和每毫升稀释液中分别加入500～1 000 μ g链霉素、500～1 000 IU青霉素。按正交设计法[3]分别添加不同种类的糖和氨基酸[4],配制不同的稀释液用于试验,配制稀释液时,必须准确称量所需的各种试剂,所用试剂为生化试剂,纯度为分析纯。

本试验材料选取两种不同类型的茼蒿为：“小叶茼蒿”和“大叶茼蒿”，于2016年9月定植于吉林省农业科学院蔬菜基地。

1.3.3 精液的稀释方法 冷冻精液的稀释方法采用一步稀释法。一步稀释法是根据牛精液的采精量,精子密度和按每支细管精液最终含2 000～2 500万个精子,有效精子数800万以上,确定添加稀释液的数量,一次加足所需稀释液的数量。一步法稀释在加入稀释液时,稀释液的温度和精液温度相差不能超过5℃。

不同种类稀释液的试验结果见表1。

我左冲右突，从密密的树丛中挤过去摘了两丫桃花，脸上居然划了一道血口子，不留神让一株狗儿刺拉了一下。学着绅士的模样，我毕恭毕敬地献给女友，一脸虔诚，“嫁给我吧，亲爱的。”

1.4 BMY牛精液品质的检查

1.5 精液的分装

稀释后的精液在室温下用MRS—3分装印字一体机把精液分装于塑料细管后封口印字标记。

1.6 平衡

1.7 精液的冷冻、解冻、包装和储存

2 结果与分析

2.1 不同种类稀释液的效果

田铭拒接范青青的电话，但范青青直接找上门，堵住他：“我今晚约你看星星。”范青青偏着头对着他笑，笑得胸有成竹。田铭不语。

表2 添加不同种氨基酸和水平的稀释液BMY牛精液冻精解冻效果比较表

分装标记清楚的精液放入+4℃的冰箱中平衡2～4 h。

从表1和表2看出,对需试验的不同组合而成的稀释液,试验时先将牛精液分成九等分,然后在精液中分别加入等量的不同种类的冷冻稀释液,进行不同组合稀释液冷冻效果的比较。从表1的结果经显著性检验和多重比较得出,A糖不同水平之间差异不明显(P>0.05),B糖不同水平之间的差异极显著(P<0.01),B1与B2、B3的差异均极显著,B2与B3的差异也极显著;C1与C2、C3的差异均极显著,C2与C3的差异不显著;不同种糖之间亦无交互作用。添加不同种糖类和水平的稀释液稀释BMY牛原精效果,A糖和C糖不同水平之间差异不明显(P>0.05);B糖不同水平之间的差异极显著(P<0.01),B1与B3的差异极显著,与B2的差异不显著,B2与 B3的差异不明显;最佳的组合是A2B1C1。

2.2 BMY牛电刺激法的采精结果

BMY牛用电刺激法采精,收集和测定公BMY牛的射精量、精子密度,测定得出公BMY牛的精液量为 9.21±3.66 mL,精子密度为6.99±5.05亿/mL,原精活力为0.54±.014,解冻活力0.357±0.029,BMY牛采精成功率为75.3%。冻精产量283±196剂。

3 讨论

3.1 优选出冷冻保存效果较好的冷冻稀释液

T RIS—果糖为基础液添加不同的糖类和氨基酸所得的新稀释液获得了较好的效果,以添加蔗糖和乳糖的效果明显,添加氨基酸的效果未能获得明显的效果,有待进一步完善试验研究方案,提高试验的精确度,冷冻稀释液是影响BMY精液冷冻效果的主要因素,还应进行系统地筛选,今后仍需做深入的试验。不同季节的差异不明显,不同年度间存在显著的差异,不同冷冻方法的冷冻解冻效果存在极显著的差异,应深入进行不同冷冻曲线冷冻解冻效果的研究,不同解冻温度,冻精的解冻活力差异极显著,操作人员间不同熟练程度明显存在差异。这与有关报道相一致。

3.2 稀释液种类和成分是影响牛精液效果的重要因素

虽然对原精的保存结果无明显差异,对精液的冷冻保存效果差异却较大,稀释液中糖类除了提供能量外,还具有一定的防冻保护作用,卵黄对精子抗冻防冻具有重要的作用,TRIS能维持精子细胞内外PH值的平衡和较好的防冻保护作用[6]。

[1] 吴丽丽,杨国荣,刘学洪,等.BM Y和婆罗门牛早期生长性状遗传力研究[J].黄牛杂志,2005,31(3):12-14.

[2] 李晓强,陈兴平,贾永红,等.牛冷冻精液技术研究进展[J].中国牛业科学,2006,32(5):59-62+66.

[3] 明道绪.生物统计附试验设计[M].北京:中国农业出版社,2004.

[4] 全国畜牧总站等.牛冷冻精液生产技术与管理[C].115.

[5] 武英.猪精液冷冻技术研究[J].中国畜牧杂志,1993,(3):6-8.

[6] 郭年潘(摘译).绵羊精液冷冻保存技术研究综述[J].国外畜牧科技,1995,22(3)(上)30-34,(下)22-27.