根癌农杆菌介导烟曲霉遗传转化的研究

张艳华,贺 丹,王 丽*

(1.吉林大学白求恩医学院,吉林 长春 130021;2.吉林大学植物科学学院,吉林 长春 130062）

烟曲霉(Aspergillus fumigatus）是自然界普遍存在的丝状真菌,也是重要的条件致病菌。近年来,随着抗生素、抗肿瘤药物、糖皮质激素的广泛应用,器官、骨髓移植、介入治疗等新型诊治技术的开展,及恶性血液病和艾滋病等免疫受损人群的扩大,由烟曲霉引起的系统性感染,即侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA）发病率不断升高,仅次于假丝酵母(Candida）引起的感染,病死率达60%-100%,成为白血病和骨髓移植等重症免疫受损患者死亡的主要原因[1,2]。

人们对烟曲霉的生物学特性,包括生长率、耐热性、有性阶段、代谢产物、致病性、耐药性等还没有深入了解。1998年英国曼彻斯特大学Dr.David Denning协调多国科学家,以临床分离烟曲霉菌株Af293为对象,启动了烟曲霉基因组测序项目,已于2005年完成[3],为研究烟曲霉生物学特征,探讨致病、耐药机制及寻找药物靶标提供了条件。

1 烟曲霉基因组概述

烟曲霉基因组序列信息表明,Af293包括8条大小从1.8-4.9Mb的染色体,共29.4 MB,G+C含量49.9%。预测有9926个基因编码蛋白质,基因的平均长度为1 431 bp,大约有三分之一基因的功能是未知的。与构巢曲霉和米曲霉基因组相比较,发现约500个烟曲霉独特基因。另外发现,烟曲霉含有一个用于异宗配合的完整补体,一个与酵母完全不同的细胞壁组装过程,至少有28个基因簇编码的蛋白质参与次级代谢和产生毒素,至少有168个药物、毒素和大分子的外排泵[4]。

虽然通过计算机分析对基因功能在理论上进行了推测,但仍有大量未知功能基因需要确定。目前,结合全基因组序列信息,利用从位点到表型的反向遗传学策略,构建覆盖全基因组的突变体库,已广泛用于功能基因组学研究。

2 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化

近年来发展的根癌农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation,ATMT）技术,是获得突变体的有利工具。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性土壤杆菌,含有肿瘤诱导(Tumor Inducing,Ti）质粒。Ti质粒上包括转移DNA(T-DNA）区、毒性区(Vir区）以及冠瘿碱代谢基因编码区。T-DNA两端是两个长25 bp的同向重复序列,分别称为左边界(LB）和右边界(RB）。当植物受到伤害时,Ti质粒在Vir基因和其它蛋白质的协助下,将TDNA插入到植物染色体中。为使Ti质粒适于生物技术的需要,现已对Ti质粒进行了改造,发展了双元载体系统,即由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性质粒组成[5]。目前,根癌农杆菌已成功用于植物细胞的遗传转化。

1995年Bundock等人[6]利用ATMT技术转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae）,开创了农杆菌介导真菌遗传转化的先河。随后,该技术也被用于其它丝状真菌的转化,如粗糙脉孢霉(Neurospora crassa）、瑞氏木霉(Trichodema Reesei）、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea）、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysprum）、镰形刺盘孢霉(Colletotrichum falcatum）、巴克斯霉(Backusella lamprospora）,等[7-10]。这些开创性的工作为丝状真菌遗传转化开辟了一条全新而有效的途径。随着ATMT技术的逐渐成熟,该方法也已用于黑曲霉(Aspergillus niger）,泡盛曲霉(Aspergillus awamori）和巨大曲霉(Aspergillus giganteus）等曲霉遗传转化的研究[11,12]。

ATMT丰富了丝状真菌的转化技术,与传统的转化方法(如脂质体转化法、电转化法、PEG法等）相比,具有很多优点[11,12,13]:(1）转化受体类型多:传统真菌转化方法,如电转化法,需制备原生质体,不同真菌原生质体制备方法差异很大。而ATMT转化的受体材料类型多,既可用原生质体、也可用萌发的孢子、分生孢子、菌丝体,甚至是真菌的子实体均可;(2）转化效率高:对大多数丝状真菌而言,ATMT法比其他转化方法的效率高得多。利用ATMT转化泡盛曲霉(A.awamori）的效率比PEG法高600倍,球毛壳菌(Chaetomium globosum）和哈茨木霉(Trichoderma harzianum）进行转化也得到了类似的结果;(3）单拷贝的T-DNA插入:实验表明,80%的F.oxysporum的ATMT转化子、60%的M.grisea的ATMT转化子都是单拷贝插入,便于对突变体进行遗传分析;(4）转化子稳定:ATMT转化米根霉(Rhizopus oryzae）所获得的转化子,其有丝分裂的稳定性是100%,而利用PEG法获得的转化子,其有丝分裂只有0.01-0.5%是稳定的;(5）方法简便:不需复杂的设备仪器,采用质粒拯救(plasmid resuce）或TAIL-PCR即可克隆出T-DNA所标签的序列。

基于上述优点,使ATMT方法在丝状真菌转化中得到越来越广泛的应用。一方面,构建目标基因的敲除载体,利用农杆菌介导的遗传转化,T-DNA以同源重组的方式整合到宿主基因组,成为基因敲除或替换的有效手段;另一方面,当根癌农杆菌T-DNA中不存在与受体菌染色体同源序列时,TDNA随机插入到宿主染色体基因组中,获得插入突变,利用T-DNA标签快速分离标记的基因,在丝状真菌功能基因研究中非常有用。

目前,该技术已用于稻瘟病菌、木霉、镰刀菌等多种重要丝状真菌的T-DNA插入突变体库的构建,并克隆了一些与致病、生长相关的基因[8,9,14]。

3 根癌农杆菌介导的烟曲霉遗传转化

在烟曲霉基因组序列完成之际,该技术成为烟曲霉功能基因组研究的重要手段。在随机插入突变方面,Janyce等[15]将烟曲霉分生孢子(1×107个/ml）和携带有潮霉素抗性质粒的根癌农杆菌(OD600=0.6）按一定比例混合,24℃诱导培养48小时,然后转移至筛选培养基,筛选转化子,其转化效率可达100个转化子/107个孢子。获得的转化子大多数以单拷贝T-DNA的形式随机整合,且转化子后代有丝分裂性状稳定。

在基因定向整合方面,Janyce等[15]利用双元载体pDHt/sk,以烟曲霉alb1为靶基因(alb1基因编码聚酮合成酶,该基因缺失将导致烟曲霉产生白化的分生孢子）,构建了含有潮霉素抗性的alb1基因敲除载体,并导入农杆菌EHA105中。将农杆菌EHA105与烟曲霉B-5233分生孢子共培养,获得大量转化子。其中66%转化子产生白化的分生孢子,34%转化子产生蓝绿分生孢子,遗传转化效率远远高于原生质体法。

李若瑜等[16]以 pyrG为筛选标记,利用双元载体pDHt/sk构建烟曲霉fap1和sho1基因的打靶载体,利用根癌农杆菌与烟曲霉分生孢子共培养,筛选转化子,fap1基因、sho1基因同源重组率分别为44%和35%。

4 结束语

在未来一段时期,真菌感染的发生仍然会呈上升趋势,开展高危人群真菌感染的前瞻性研究,尤其是病原真菌的基因组学和蛋白组学研究,分析危险因素,阐明其生物学特性,发掘致病基因和耐药基因,开发强有力的抗真菌药物,将对真菌感染的防治发挥重要作用。

上述研究表明,ATMT技术是烟曲霉随机插入突变和基因定向整合的有力工具。由此,利用农杆菌介导的T-DNA插入突变,快速构建覆盖烟曲霉基因组的突变体库,结合全基因组序列信息,是进行烟曲霉功能基因组学研究的有效方法。随着越来越多的丝状真菌全基因组序列分析完成,ATMT必将成为丝状真菌遗传的有效手段,特别是在病原真菌的基因克隆和功能鉴定方面具有广阔的应用前景。

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