Notch信号通路在肝癌发生和发展中的研究进展

王伟敏 综述 徐 泱 樊 嘉, 审校

(1.复旦大学生物医学研究院,上海 200032;2.复旦大学附属中山医院肝癌研究所,上海 200032)

Notch基因发现于1919年,它的缺失可导致果蝇翅缘缺刻[1]。随后研究发现,Notch在无脊椎动物和脊椎动物的多个物种中均有表达,它不仅在许多器官及细胞的正常发育中起作用,还与一些肿瘤的发生、发展相关。自Notch在人类T淋巴母细胞白血病中首先被鉴定以来[2],在多种肿瘤中发现有Notch信号通路的异常激活。现就Notch信号通路在肝癌中的研究进展做一综述。

1 Notch信号通路

Notch信号通路(notch signaling,以下简称NS)是由 Notch受体、配体、细胞内效应分子、调节分子及其他的效应物等组成。N-S主要通过旁侧抑制介导对多种不成熟细胞分化的抑制信号[3]。

1.1 参与N-S的主要分子 (1)Notch受体:Notch蛋白是由其基因编码的单链跨膜受体蛋白,分子量约300 kD,由2 753个氨酸残基组成,其基本结构分为胞外区(ECN)、跨膜区(TM)和胞内区(ICN)。脊椎动物中共发现了4个Notch同源体,分别编码4种Notch受体(Notch1-4)。(2)配体:可结合并激活Notch受体;人的Notch同源配体有两类:Delta样配体(Dll1、Dll3、Dll4)和 Serrate样配体(Jag1、Jag2)。(3)细胞内效应分子:一方面与ICN的RAM结构域结合,形成ICN-CSL复合物;另一方面可与核内特定的DNA序列结合,激活转录过程。

1.2 Notch的转导途径和激活方式及调节 目前广泛认可的是Notch3步裂解法[4]:Notch在furin样转化酶的作用下于S1位点发生裂解,产生的胞外区和跨膜区以二硫键相接而形成 Notch受体。当其与配体结合后,在肿瘤坏死因子-α-转化酶作用下,Notch在S2位点裂解为2个片段。C端裂解产物进一步在跨膜区S3位点发生裂变,经γ-分泌酶水解释放的ICN进入核内,其RAM区与CSL蛋白和MAML蛋白结合形成转录复合物,再募集转录辅助激活因子PCAF及P300等,激活下游靶基因转录。

Notch受体与配体结合后,可直接转至核内(放大效率低、特异性强);但多种配体共同存在,激活N-S可引发多种信号、多种调节因素通过不同机制调节Notch信号。

2 N-S和肝脏发育与再生

多种研究[5-7]显示:N-S在肝内胆管形成、血管发育中起重要作用。表达在胚胎胆管板上的Jag1与肝门束旁的间充质和肝动脉内皮上的Notch3间的相互作用,对人胎肝胆管板重塑和肝内胆系发育起作用[5]。在Alagille综合征患者,Jag1基因突变使肝内胆管发育缺陷;用AlbCre转基因小鼠进一步研究[6]发现Notch2缺失引起肝胆管板结构异常、肝内胆管结构混乱且伴有肝门区炎性纤维化和肝细胞羽毛状变性;其缺失程度与与肝内胆管异常情况呈正相关。同时,研究Jag1/Notch2双杂合子Alagille综合征模型和肝特异性Notch2缺失模型,也发现Notch功能缺失突变小鼠的胆管形态形成缺陷[7]。

Fabris等[8]研究N-S在肝脏修复中的作用,发现其缺乏导致活性胆管细胞缺失和缺少肝脏核因子的肝胆管细胞堆积,最终不能转化为胆道表型而影响肝胆管再形成。Croquelois等[9]用Notch1基因敲除小鼠模型来研究N-S在肝细胞增殖分化中的作用,发现Notch1缺失导致肝细胞持续增殖,而发展为结节性再生性增生;Notch信号通路抑制肝细胞再生和增殖。

值得注意的是,肝窦内皮细胞(LSECs)对剩余肝的肝细胞有支持作用,从肝再生到再生肝实质血管形成,都必须有LSECs的增殖。而Notch/RBP-J信号通路对LSECs起双重作用:抑制剩余肝增殖;促进再生肝增殖和功能分化[10]。N-S对肝细胞的确切作用及其机制尚未明确,尚需深入研究。

3 N-S和慢性肝炎、肝硬化、肝癌

Notch和 TGF-β协同调节Foxp3表达和维持Treg细胞,γ-分泌酶抑制剂(GSI)可抑制由Notch1、CSL和Smad结合体维持的Foxp3启动子的结合位点;活体内给予GSI使Foxp3表达减少并产生自身免疫性肝炎症状[11]。在肝硬化中,发现Notch和 Toll样受体信号通路的表达失调[12]。Gramantieri等[13]以癌旁组织为对照,分析Notch及靶基因在肝细胞肝癌(HCC)中表达情况:HCC组织中有Notch3和Notch4的异常增多;Notch3、Notch4在正常肝和癌旁慢性肝炎区不表达,Notch3在肝硬化组织为阴性,HES6 mRNA和 Notch3 mRNA在肝硬化中表达量比 HCC组织中少;Hep G2细胞系高表达Notch3,低表达Notch4及其mRNA。与HCV-4感染相关的埃及 HCC患者的c-DNA芯片显示[14]:伴有与不伴有肝硬化的HCC有22个基因差异性表达,Notch4与HCC中高表达的基因相关。Gao等[15]把肝细胞癌组织的赘生性细胞与癌旁组织相比,前者胞质中Notch1和胞核中Notch4高表达,Notch2低表达,胞核中Notch1、胞质中Notch4及Notch3表达未见异同。由此可见,Notch受体在HCC组织中表达较混乱。

多项研究[13,16-17]表明,N-S抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡。在瞬时转染 Notch的 SMMCICD7721细胞中发现,p21、p53高表达,JNK信号活性增强,周期蛋白、CDK2、磷酸化Rb表达降低,Bcl-2不表达,提示N-S作用于细胞内多条信号通路起到上述作用[13]。同样,Qi等[16]用携带Notch ICN基因的重组逆转录病毒感染SMMC7721,表达Notch1 ICN的肝癌细胞停滞于G0/G1期,并诱导肝癌周期蛋白减少,而p21高表达,说明Notch1能诱导SMMC7721细胞凋亡。Western blot还显示p53表达增高,Bcl-2、P-JNK非磷酸化的JNK表达减少,N-S诱导凋亡可能与蛋白磷酸激酶途径相关[16]。把肝癌组织块接种到Notch受体转录因子RBP-J失活的小鼠体内,肿块生长减慢,新生血管形成增加、灌流量减少,但转移性增加[17]。同时有研究[12,18-22]显示,N-S促进肝癌的发生和进展。利用实时定量 RT-PCR和 Western blot分析发现,Notch-1和HES-1在肝癌组织中高表达;Notch高表达,HuH-7的增殖、侵袭能力增强[18];Jag1在肝癌中表达明显升高,与HBx相互作用可能是肝癌发生的原因之一[19]。Dll1在肝癌组织中表达量高,并且Dll1表达升高量与肝癌的增殖能力正相关[20]。N-S还促进HepG2细胞系增殖,通过GSI抑制N-S后,肿瘤细胞的增殖也受到抑制[21]。Wurmbach等[12]发现晚期肝癌阶段与DNA复制、修复和细胞周期相关的基因表达上调,而N-S在调节细胞周期进展中有重要作用[22],至于N-S是否参与了肝癌进展尚需确证。

4 N-S和干细胞

就N-S一般作用而言,Wilson等[23]称其为干细胞的“门卫”。它影响着细胞的命运,诱导无脊椎动物的终末分化进程和哺乳动物器官系统的自我更新。但“肝癌干细胞”的确切起源、分子遗传学和HCC高侵袭机制等,还处于早期探索阶段。Notch与 TGF-β、Wnt、Shh等信号通路间的相互作用参与调节干细胞分化和肿瘤发生[24]。现就N-S与干细胞及肿瘤干细胞的关系进行简要描述。

4.1 N-S和干细胞 N-S在干细胞更新和分化中起重要作用,它促进干细胞自我更新和祖细胞增殖[25]。HES1是N-S的靶基因,整合基因组分析显示[26]:HES1主要表达在未分化的胚胎干细胞、胚胎组织、再生肝、内皮细胞和肿瘤组织中。Notch3基因在富含干/祖细胞的人乳腺球型培养中高度表达[27]。在未分化组织中,Notch及靶基因高表达提示其与干/祖细胞未分化状态高度相关。

观察小鼠胚胎定向造血干细胞集落形成,发现基质细胞激活Jag1而维持造血干细胞的未分化和自我更新[28]。N-S还可与其他信号通路交叉作用维持干细胞的状态。N-S和Wnt信号通路协同维持细胞的未分化/增殖状态,Wnt信号通路调节干/祖细胞的扩增,而N-S可影响Wnt信号通路对干细胞间隔和分化的维持作用[29]。在某些条件下,N-S与Wnt信号通路共同维持干细胞的增殖是某特定细胞系分化的基础[30]。N-S参与Hippo信号通路调节哺乳动物器官体积并作用于干细胞成分;Hippo信号通路的下游成分YAP1在干细胞中高表达,激活YAP1的小鼠肝脏体积增大;YAP1可激活NS,而后者对前者有调节作用,两者与干细胞/祖细胞、器官体积和肿瘤间有潜在联系[31]。

4.2 N-S和肿瘤干细胞 Styczynski等[32]提出肿瘤干细胞(CSCs)的假说,称其是一群转化形式的干细胞或获得自我更新成分的祖细胞。CSCs是肿瘤细胞自我更新的来源,决定了肿瘤的生物学行为(如增殖、扩散和对放化疗的反应性等)。CSCs一般都有特异性表面标志(如抗原、分子和信号通路等),信号通路调节CSCs自我更新和细胞命运的功能正逐步被阐明。

人促红细胞生成素受体的重组体诱导Jag1以Notch依赖模式增加干细胞的量和自我更新,而抑制N-S可阻断这一效应,这表明其可能维持肿瘤干细胞样细胞表型[33]。Dontu等[34]通过激活或抑制N-S,研究其在人乳腺干/祖细胞细胞命运中的决定作用,它促进乳腺干细胞自我更新及早期祖细胞增殖但不影响完全分化的乳腺上皮细胞,乳腺癌的发生可能与异常的N-S对正常的乳腺干细胞调节异常有关。磷酸酯酶和张力蛋白同系物(PTEN)参与干细胞的维持,一旦缺失将导致CSCs发育而最终致瘤,激活N-S引起PTEN下调[35],表明 N-S调节PTEN对干细胞作用。

N-S和Hedgehog-Gli1信号通路与CSCs的自我更新和致瘤性有关,且可能在放疗后CSC再生中起重要作用[36]。与肿块的分化细胞相比,肿瘤干细胞可能对细胞毒性药物和放疗引起的凋亡的抵抗性更强,其中N-S等信号级联反应的激活与DNA修复机制的增加和ABC运载体介导的药物输出可能在其对传统治疗方法抵抗中起作用[37]。

5 N-S和微环境

据报道[38-40],N-S调节肿瘤血管形成,但其确切作用尚有争议。N-S抑制肿瘤新生血管过度增殖,促进发育成熟而改善其功能[39];抑制Dll4介导通路使不成熟血管繁殖而组织灌流量减少,肿瘤生长受到抑制[38-39]。Dll4转导的荷瘤小鼠与对照组相比,其形成的血管少而小且缺氧更明显,血管影像显示肿瘤供血减少,Dll4的激活减少了肿瘤新生血管形成及血管灌流量而抑制肿瘤的生长[40]。Dou等[41]利用 Cre-Lox P介导状态的基因缺失小鼠来研究Notch转录因子下游区的RBP-J在维持血管稳态中的作用,结果显示RBP-J介导的N-S通过抑制内皮细胞增殖而维持血管内环境稳定。

Katoh等[42]提出 Wnt-FGF-Notch和 BMPShh信号通路网间的平衡对维持干/祖细胞间的内环境稳态非常重要,一旦被打破将引起先天性疾病或肿瘤。Notch与部分细胞或因子相互作用,调节肿瘤细胞的生长与侵袭性。在肿瘤微环境中,肝细胞生长因子(HGF)参与产生脉管系统和间质及侵袭性生长过程,N-S可限制HGF的活性,负调肿瘤侵袭性生长[43]。组织特异性成纤维细胞及其产生IL-6,通过上调Notch3、Jag1促进乳腺癌细胞的生长和侵袭[44]。

在多种干细胞/祖细胞系中,在N-S的参与下,缺氧可维持未分化细胞的状态;激活Notch应答启动子和增加Notch下游基因的表达,阻断Notch依赖的神经元和肌原的分化状态;ICN和HIF-1α间的相互作用和HIF-1α参与N-S的激活都需要低氧环境[45]。这一现象也为阐明N-S控制细胞分化和维持干细胞状态的机制提供了新视角。

6 结语与展望

综上所述,N-S与肝癌关系相当密切,但其在肝癌发生、发展过程中却有不同甚至相反的作用。可能原因有:成员多类型性及其作用多样性;信号转导多途径性;与多条信号途径间出现“串话”等。只有明确N-S作用,才可以在肝癌的治疗中有针对性地选择而避免治疗的盲目性。GSI通过抑制N-S而抑制肝癌细胞系的增殖[22]。可以预言,以N-S为靶点的肿瘤基因治疗及新药开发,将为肝癌治疗研究开辟新领域。如:就N-S本身而言,可用外源性配体激活或者用拮抗剂抑制N-S;针对Dll,进行肿瘤的抗血管治疗;针对CSCs的特性,进行肝癌干细胞的治疗;改变肿瘤干细胞所处的微环境而影响其生物学行为。但前提是必须有方法特异确定“肝癌干细胞”,从细胞表面标志到干细胞标志以及相关信号通路对其进行鉴定的研究尚需探索。

目前,N-S与肝癌的关系尚待阐明的问题还有很多,如N-S在肝癌发生、发展的不同环节所起的作用及相关机制;生理状态下与肝癌中的N-S是否相同;改变Notch表达是否会对正常细胞有不良影响;肝癌干细胞的确定及其与N-S的联系;以及如何开展N-S的靶向治疗及其临床意义等。

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