Der f2重组蛋白用于变应性鼻炎患者血清ELISA检测

徐 枫 王建中 张利能

(1.复旦大学附属中山医院耳鼻喉科,上海 200032;2.复旦大学上海医学院生物化学和分子生物学系,上海 200032)

变应原检查对变应性鼻炎诊断和治疗有很重要的意义。现在有多种变应原检查方法,体内检查有皮内试验、点刺试验[1]、斑贴试验和激发试验[2]等;体外实验包括嗜碱粒细胞组胺释放实验、放射变应原吸附实验[3],UniCap[4]和酶免实验[5]等。用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测IgE、IgG,可以达到半定量的要求,是一种比较经济、简便的检测方法。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 粉尘螨过敏患者血清 26例变应性鼻炎患者接受常见变应原皮肤点刺试验,其中粉尘螨点刺反应阳性患者24例,粉尘螨反应阴性患者2例。抽取5 mL静脉血,分离血清,-80℃保存。Der f2特异性IgE阳性血清盘(panel)来自于美国PlasmaL-ab International和 Greer Laboratories,Inc.公司 。

1.1.2 临床点刺试验材料 粉尘螨变应原点刺液、点刺针为Allergopharma产品。

1.1.3 BCA蛋白质定量试剂盒 购自Pierce公司。

1.1.4 粉尘螨蛋白 原核表达纯化的野生型Der f2。

1.1.5 ELISA试剂及材料 包被试剂:0.05 mol◦L-1碳酸盐缓冲液(pH 9.0)。洗涤液:1×PBS,加入Tween-20至0.02%浓度。封闭液:以洗涤液配制成含3%BSA的溶液。HRP标记的抗人IgE抗体、TMB底物溶液和2N H2 SO4终止液购自KPL公司。96孔酶标板购自Nunc公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Der f2原核表达及纯化 依据粉尘螨变应原蛋白质第2组分序列设计引物。上下游引物序列分别加入 Eco R I和 Bam HⅠ位点,以利于与pBV220载体连接。以粉尘螨变应原蛋白质第2组分cDNA为模板,以PCR方法扩增编码序列。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,切取特异性PCR条带所在的胶条,按照胶回收试剂盒提取PCR产物。将胶回收的PCR产物与 T载体连接。连接产物转化DH5α感受态细胞,通过蓝白斑筛选,挑取白色菌落摇菌,质粒小抽,以Eco RI+Bam H I双酶切重组T载体,将Der f2 DNA片段与p BV220质粒连接。连接产物转化DH 5α,转化菌送检测序。用重组质粒转化BL21菌诱导表达。

工程菌母液按1%体积比接种于2×YT培养液中,培养至OD600=0.8,再诱导培养6 h。菌体沉淀重悬于50 mL细菌裂解液中;超声破菌后,4℃12 000 r◦min-1离心30 min,弃上清液。包涵体沉淀洗涤后,以变性液溶解包涵体沉淀。采用Amersham FPLC系统,在线对Der f2进行纯化、复性。A280检测收集蛋白峰,每管 1 mL。经 Tricine-SDS-PAGE银染后观察,合并Der f2蛋白峰。

1.2.2 皮肤点刺试验 按照Allergopharma试剂盒说明书操作规范,在每例患者前臂点刺常见变应原,同时点刺组胺和0.9%氯化钠溶液,分别作为阳性对照和阴性对照。点刺后20 min观察反应,以皮丘直径大于组胺点刺皮丘直径判定为阳性。

1.2.3 ELISA包被 蛋白质以包被液稀释成60 ng◦mL-1的浓度,每孔加入100μL,4℃包被过夜。以洗涤液洗涤3次,每次5 min。封闭:每孔加300 μL封闭液,4℃封闭过夜。反应:每孔加入100μL血清或5倍稀释的血清,37℃反应2 h。以洗涤液洗涤4次,每次5 min。HRP标记的抗抗体反应:每孔加入 100μL 1∶3 000稀释的 HRP-anti-human IgE,37℃反应 2 h。以洗涤液洗涤4次,每次 5 min。底物呈色:每孔加入100μL底物液,37℃反应15 min后,加入100μL终止液。读数:以570 nm和450 nm波长读取OD 570-OD450值。

2 结 果

2.1 pBV220-wt Der f2重组质粒的构建 将wt Der f2和mu Der f2分别插入载体pBV220,构建成pBV220-wt Der f2和 pBV 220-mu Der f2重组质粒。以EcoR I和BamHⅠ酶切产生与Der f2基因大小一致的片段。过 DNA测序验证,结果表明DNA序列与NCBI的序列一致。

2.2 粉尘螨Der f2重组蛋白的表达纯化 wt Der f2蛋白在42℃诱导条件下形成了包涵体。菌体经超声破碎后,充分洗涤包涵体以除去可溶性蛋白以及膜蛋白。将包涵体溶于变性液中,进行Sephacryl S-100HR柱层析分离及复性,通过分子筛除去包涵体中的杂蛋白,同时w t Der f2蛋白通过填料介质的不断吸附-解离而正确折叠,从而得到复性的wt Der f2蛋白(图1)。

2.3 检测方法的线性范围和灵敏度 用PlasmaLab粉尘螨Derf2变应原特异性IgE标准血清(1.66 U◦mL-1～100 U◦mL-1),制作标准曲线(图2)。对测得的OD值和Der f2特异性IgE浓度作回归分析,回归系数R2值为0.996。按照ELISA灵敏度计算方法[6],对0 U◦mL-1标准液进行10次测试,求得零剂量点光密度均值(¯x)和标准差(s),将¯x+2s值插值运算,得到灵敏度值为0.73 U◦mL-1。

2.4 临床血清样品的检测 在26例变应性鼻炎患者中24例粉尘螨点刺反应呈现阳性,2例的点刺反应阴性。以野生型Der f2为包被材料的ELISA试剂盒,分析24例点刺反应阳性的患者血清中Der f2特异性IgE的浓度,按照国际sIgE分级标准分为阳性和阴性[4],结果22例阳性,阳性率为91.7%。

3 讨 论

变应性鼻炎的实验诊断包括体内和体外方法,但体内方法无法进行定量分析。在体外方法的变应原特异性IgE检测试剂中,Pharmacia UniCap特异性IgE检测系统具有较好的检测效率。Pharmacia UniCap的优点是,采用结合大量变应原的高分子化合物固相,具有较高的灵敏度,特别是多种变应原共同偶联于同一固相,对于变应原的筛查具有其它试剂所没有的灵敏性。我们根据经典的间接ELISA原理设计的Der f2特异性IgE检测试剂,可定量分析血清中Der f2特异性IgE,其灵敏度等指标与商业试剂具有平行性。已符合ng级分析要求,达到了国际sIgE分级中判断阳性和阴性的截点标准。

由于ELISA微孔包被有足够量纯化的变应原蛋白质,因此在针对性检查患者血清中某一特定变应原IgE时,ELISA同样具有与Pharmacia UniCap相当的灵敏性。基于这种考虑,研究设计了Der f2特异性IgEELISA检测试剂。事实上,ELISA方法具备相当高的测试效率,广泛用于患者血清中抗原或抗体的分析。通过标记信号放大系统的改进,ELISA可以应用于皮克(pg,10-12g)级IgE定量分析。

目前,变应原筛查和定量分析试剂系统采用世界卫生组织国际IgE参考标准品(75/502),这有助于提高通过不同方法获得的总IgE和特异性IgE结果的平行性,本研究检测试剂也采用同样的标准。由于不同试剂系统中固相包被的变应原蛋白质不同,常缺乏标准化。本研究检测试剂中固相包被的变应原蛋白是纯化的Der f2,重组表达的变应原蛋白质可以很好地解决固相包被的变应原蛋白质标准化问题,此点是对包括UniCap等试剂系统的一个改进。

本研究设计的sIgE ELISA实验可为螨类变应原引起的持续性变应性鼻炎提供辅助诊断依据。若用HRP标记的抗IgG抗体代替本检测试剂中H RP标记的抗IgE二抗,则sIgG ELISA可用于检测螨类特异免疫治疗过程中机体产生的特定亚型IgG的浓度。虽然已有人开始以变应原蛋白质微阵列技术来筛查患者敏感的变应原[7],但在常年性变应性鼻炎变应原比较固定的情况下,本研究设计的变应原特异性IgE ELISA方法依然有利于明确诊断,同时,可以进一步检测特异性免疫治疗效果。

1 徐慧珍,徐林根,姜 辉,等.变应原皮肤点剌试验在变应性鼻炎中的临床意义[J].中国临床医学,2004,11(3):435-436.

2 Kanthawatana S,Maturim W,Fooanan S,et al.Skin prick reaction and nasal provocation response in diagnosisof nasal allergy to the house dust mite[J].Ann Allergy Asthma Immunol,1997,79(5):427-430.

3 Price JA,Reiser J,Longbottom JL,et al.Inhalant allergy in asthmatic child ren:skin prick test,radioallergosorbent test and chemiluminescent assay compared with allergen levels in their mattress dusts[J].International archives of allergy and applied immunology,1989,88(1-2):183-184.

4 Ricci G,Capelli M,Miniero R,et al.A comparison of different allergometric tests,skin prick test,Pharmacia UniCAP and ADVIA Centaur,for diagnosis of allergic diseases in children[J].Allergy,2003,58(1):38-45.

5 徐 枫,王建中,黄凤娥,等.间接ELISA法对常年性变应性鼻炎患者血清中屋尘螨变应原特异性IgE的分析[J].中国临床医学,2005,12(6):1086-1088.

6 Grodzinsky E,Ivarsson A,Juto P,et al.New automated immunoassay measuring immunoglobulin A antigliadin antibodies for prediction of celiac disease in childhood[J].Clin Diagn Lab Immunol,2001,8(3):564-570.

7 Kim TE,Park SW,Cho NY,et al.Quantitative measurement of serum allergen-specific IgE on p rotein chip[J].Experimental&molecular medicine,2002,34(2):152-158.