鱼腥草总生物碱提取工艺的研究

梁慧超,孟江,卢国勇,李雪英

(广东药学院中药学院,广州 510006)

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thumb.的干燥地上部分及新鲜全草,是卫生部规定的药食两用的极具开发前途的资源之一,具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效,主要用于肺脓疡、痰热咳嗽、热痢热淋、痈疮肿毒的治疗[1]。鱼腥草所含生物碱主要有头花千金藤二酮(cepharadione B)、马兜铃酸内酰胺B(aristolactam B)、马兜铃酸内酰胺AⅡ(aristolactam AⅡ)和胡椒内酰胺(piperolactam A)等[2]。既往研究发现鱼腥草生物碱在体外对5种人肿瘤细胞株(A-549、SK-OV-3、SK-MEL-2、XF-498、HCT-15)具有一定的细胞毒作用[3]。课题组研究发现鱼腥草生物碱有效部位对Lewis肺癌瘤荷瘤小鼠实体瘤的生长具有很强的抑制率(论文待发表)。但目前对鱼腥草总生物碱的提取工艺研究未见报道。本实验以总生物碱含量、得率为指标,采用正交试验对鱼腥草总生物碱的提取工艺进行优选。

1 仪器与试药

UV-2450紫外分光光度计(日本岛津公司);RE5299型旋转蒸发仪(河南巩义市仪器厂);双B循环水式多用真空泵(SHB-IV,郑州长城科工贸有限公司)。GZX-9240 MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);超声波清洗机(上海博迅实业有限公司);电子天平(AY l20,SHAM AOZU CORPOPAIT ION JAPAN)。胡椒内酰胺(实验室自制,纯度大于98%);盐酸,乙醇,均为分析纯。鱼腥草采自广东省梅州市五华县,经广东药学院刘基柱副教授鉴定为三白草科蕺菜Houttuynia cordata Thunb.。

2 方法与结果

2.1 鱼腥草总生物碱含量测定方法的建立

对照品溶液制备：精密称取已恒重的胡椒内酰胺对照品适量,置50 m l容量瓶中,加95%乙醇定容,摇匀即得0.110 mg/m l的对照品溶液。供试液溶液的制备：精密称取鱼腥草1g,按正交设计表进行提取、过滤、浓缩得浸膏,称重计算得率;再将浸膏加95%乙醇定容至100 m l,再移取1 m l,定容至10 m l,摇匀,即得。最大吸收波长的选择：分别取对照品溶液、供试品溶液和乙醇空白溶液在200-800 nm范围扫描,结果发现胡椒内酰胺和样品液在276 nm都有最大吸收,且吸收峰相同,而空白对照液在276 nm处几乎没有吸收,故本实验选择276 nm为测定波长。标准曲线制作：精密移取对照品溶液0.0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 m l分别置于10m l容量瓶中,加95%乙醇定容,于276 nm处测定吸光度[A,旧称光密度(OD)]值,以A值为纵坐标,浓度C为横坐标,计算得回归方程A=109.78C-0.028,R2=0.9935,胡椒内酰胺在0.016 5～0.082 5 m g/m l浓度范围内与A值呈良好的线性关系。精密度试验：取对照品溶液于276nm处测定A值,连续测定6次,RSD为0.085%,表明精密性较好。稳定性试验：取供试液于276 nm处测定A值,每隔20m in测定1次,连续测定6次,结果在2 h内稳定,RSD为0.80%。重复性试验：称取鱼腥草自然干品6份,按供试品溶液制备方法制备样品溶液。测定A值,RSD为2.17%,表明重复性好。

2.2 鱼腥草总生物碱提取方法

回流提取法：称取鱼腥草3 g,加10倍体积95%乙醇,回流提取3次,每次1.5 h,过滤,浓缩得干浸膏,按供试样品溶液的配制项下操作,计算得率和总生物碱的含量,结果见表1。超声波提取法：称取鱼腥草3 g,加10倍体积95%乙醇,超声提取3次,每次1 h,过滤,浓缩得干浸膏,按供试样品溶液的配制项下操作,计算得率和总生物碱的含量,结果见表1。冷浸法：称取鱼腥草3 g,加10倍体积95%乙醇浸泡24 h,过滤,浓缩得干浸膏,按供试样品溶液的配制项下操作,计算得率和总生物碱的含量,结果见表1。冷浸-超声提取法：称取鱼腥草3 g,加10倍体积95%乙醇浸泡24 h后,超声提取30m in,离心,残渣同上再提取1次,合并上清液,过滤,浓缩得干浸膏,按供试样品溶液的配制项下操作,计算得率和总生物碱的含量,结果见表1。

表1 不同提取方法比较Tab.1 Comparing thedifferent extraction methods

从不同提取方法的实验结果发现,回流提取法所得的总生物碱的含量和得率都高于其它提取方法,因此确定回流提取法为最佳提取方法。

2.3 正交试验法优化鱼腥草总生物碱回流提取最佳工艺

制定因素水平表。以料液比、乙醇浓度、提取时间和提取次数为考察因素,每因素选取3个水平,进行L9(34)正交表安排试验[4-6]。以总生物碱得率及含量作为衡量提取效率的双重客观指标,优选最佳工艺。因素水平安排见表2,结果见表3。

加权法综合评价鱼腥草总生物碱提取工艺。最佳提取条件要满足总生物碱得率高并且含量也高,因此采用加权评分法综合评估鱼腥草总生物碱提取条件。评分标准为：将各项指标除以该列最大值再乘以100,为其该项得分。通过这样处理,使总生物碱得率和含量转化为0～100之间的数。根据总生物碱得率(x)和含量(y)的作用,而确定两者的权重系数分别为0.4和0.6,对两项指标进行加权求和,通过公式z=0.4x+0.6y,得到综合评分(z)[7]。加权评分结果及方差分析见表3、表4。

2.4 结果分析

从正交试验结果和方差分析表可知,因素B(乙醇浓度)对鱼腥草总生物碱提取有显著性影响,而因素A(料液比),因素C(提取时间)及因素D(提取次数)对鱼腥草总生物碱提取无显著性影响。由R得出影响因素大小顺序为B＞D＞A＞C,根据实际情况结合经济效益,C(提取时间)选择C2即2 h,最佳提取工艺为A1 B2 C2 D3,即料液比为1∶20,提取次数为3次,提取时间为2 h,乙醇浓度为85%。

表2 因素水平表Tab.2 Factor level

表3 正交试验及结果Tab.3 Orthogonal exper imentaldesign and results

2.5 验证实验

按照理论最佳工艺,进行重复实验,总生物碱含量和得率分别为7.23%,28.65%,与实验结果一致。

3 讨论

从表1可以看出,采用4种不同的提取方法进行提取,所得提取物生物碱含量和提取物得率的高低顺序均为：回流提取法＞冷浸-超声提取法＞超声波提取法＞冷浸法。冷浸法避免了加热,使其中的热敏性成分有了一定的安全性,但所用溶剂量均较大,提取时间较长,操作费时麻烦,提取效率最低。超声提取具有提取快速、安全,操作简单,节省时间和能源,提取率较高等优点,并且可以避免长时间高温加热所引起的物质的分解,适合于提取热不稳定成分,也是目前提取中药有效成分常用的一种方法。回流提取法无论生物碱得率还是含量都较高,因此选取回流提取作为鱼腥草生物碱最佳提取方法。

表4 方差分析Tab.4 variance analysis

本实验首次以胡椒内酰胺为指标,计算鱼腥草生物碱的得率和含量来优选生物碱的最佳提取方法和提取工艺,综合考虑各因素的影响,得到最佳提取工艺：加20倍药材的85%乙醇,提取3次,每次为1h。该工艺既可保证得率,又提高了生物碱的含量,为鱼腥草生物碱的进一步开发研究提供理论依据。

[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：化学工业出版社,2010：208.

[2] Jong TT,Jean MY.A lkaloids from H outtuynia cordata[J].Jou rnal of the Chin Chem Soci,1993,40：301-303.

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