星点设计-响应面法优化傣药竹叶兰总黄酮超声-双水相提取工艺

付艳丽， 高云涛， 李竞春， 贝玉祥， 王 辰， 王明华

(云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明650031)

竹叶兰(Arundina graminifoli(D.Don)Hochr)为兰科(Orchidaceae)、竹叶兰属(Arundina)植物，又名黄竹参［1］，傣药名纹尚海［2］，主要分布于热带和亚热带地区，是一种重要的傣药，其药用部位主要为根茎，具有清热解毒、祛风除湿、散瘀止痛、消炎、利尿等作用［3-5］。

传统中药活性成分提取工艺的优化有正交设计法［6］和均匀设计［7］法。星点设计(Central Composite Design，CCD)［8-12］是在析因设计的基础上，由析因点及中心点而形成的可进行线性或非线性拟合的实验设计方法，它具有试验次数少、试验精度高等特点，在药学应用上成效显著。响应面分析法(Response Surface Method，RSM)［13-16］是通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间函数关系的一种统计方法，使用起来直观、方便、效果较好。

本实验以超声提取技术［17-20］与丙醇-硫酸铵双水相萃取［21-23］体系进行耦合［24］，在常温条件下，从傣族雅解药竹叶兰中提取总黄酮物质，采用星点设计结合响应面分析法进行优化，得到竹叶兰总黄酮最佳提取工艺，为探讨该法在民族特色药提取工艺优化方面提供了实验依据。

1 实验部分

1.1 材料与方法

1.1.1 实验材料与试剂 竹叶兰(购于西双版纳州傣医医院)，用前粉碎至80 mesh以下;芦丁标准品(购于中国药品生物制品检定所，批号:10008);5%NaNO2溶液;10%Al(NO3)3溶液;4%NaOH溶液。所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.1.2 仪器 AS3120A超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);7200型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 丙醇-硫酸铵双水相体系的形成 准确配制一定浓度的硫酸铵水溶液，吸取一定体积于25 mL比色管，然后用已知浓度的正丙醇定容至刻度，确保溶液混合后分相，即得到25 mL丙醇-硫酸铵双水相体系的混合液。

1.2.2 竹叶兰总黄酮的提取和测定 准确称取1.00 g样品于100 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL丙醇-硫酸铵双水相体系混合液，静置1 h，超声提取50 min后，抽滤，滤液转入60 mL分液漏斗中，待完全分相后，取上层清液，以70%乙醇溶液定容至25 mL作为待测液。总黄酮测定采用NaNO2-Al(NO3)3分光光度法，以芦丁为标准，测定波长510 nm，回归方程:A=12.546C+0.005 8，R2=0.999 8。

1.3 实验设计

1.3.1 因子设计 选择超声时间、丙醇浓度、硫酸铵用量作为本次实验的主要影响因子，设计响应面因素水平分布，如表1所示。

表1 因素水平设计Table 1 Experiment assignment of the levels and factors

1.3.2 星点设计方案 根据中心组合设计原理，以超声时间、丙醇浓度、硫酸铵用量三个因素为自变量X1、X2、X3，总黄酮得率为响应值，设计了共20个实验点的响应面分析实验，其中14个析因点，6个零点，实验方案见表2。

表2 实验设计与结果Table 2 Experiment design and the results

2 结果与讨论

2.1 回归模型 以竹叶兰总黄酮的提取率为响应值，对各因素进行回归拟合，得到响应值Y和各因子之间的二次回归方程(R2=0.895 1):

该方程P＜0.000 1，所以该模型是显著的，可用来预测超声耦合丙醇-硫酸铵双水相体系提取竹叶兰中总黄酮物质的最佳提取工艺。

2.2 方差分析 表3中统计分析数据给出了线性项、二次项、以及交互项对竹叶兰总黄酮提取得率的影响，其中线性项，硫酸铵用量(P＜0.000 1)和超声时间(P＜0.000 1)，所有二次项以及交互项中，丙醇浓度和硫酸铵用量的交互作用(P=0.000 2)、丙醇浓度和超声时间的交互作用(P=0.004 4)对模型具有高度显著性。硫酸铵用量和超声时间的交互作用显著(P＜0.05)。线性项中，丙醇浓度影响不显著(P=0.354 1)。

2.3 响应面分析 保持三个变量中的一个不变，得到超声时间、丙醇浓度、硫酸铵用量之间其他两个因素之间的三维响应面曲线，见下图1a～c。

表3 响应面二次模型的方差分析结果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

图1a～c超声时间(X1)、硫酸铵用量(X2)和丙醇浓度(X3)对总黄酮得率(%)影响的3D响应面曲线Fig.1 a～c Response surface(3D)showing the effect of ultrasonic time(X1)，ammonium sulfate(X2)and propanol concentration(X3)on the response value of general flavonoids yield

图a和b显示，总黄酮得率随着超声时间的延长而提高，50 min左右趋于稳定值;图a和c显示，硫酸铵影响并不显著，大约在硫酸铵浓度22.5%;图b和图c显示，丙醇浓度对黄酮得率的影响最显著，黄酮得率随着丙醇浓度的增大明显上升，大约55%趋于稳定。

2.4 愿望函数优化及实验验证 Design Expert软件为响应面分析提供了最佳条件化优化模块，在进行数字化优化时，超声时间为定值50 min，硫酸铵用量在10% ～35%范围内，丙醇浓度选择在30% ～70%范围内，总黄酮得率选择最大值。见图2。

由软件分析得到最佳提取工艺为:超声时间50 min，硫酸铵用量20.54%，丙醇浓度54.81%，黄酮得率预测值为3.65%，考虑实际情况，将各因素条件取整，从而确定竹叶兰总黄酮的最佳提取工艺:硫酸铵用量20%，丙醇浓度55%，超声时间50 min。

图2 愿望函数优化设计Fig.2 Desirability ramp for numerical optimization

在此条件下进行实验验证，结果黄酮平均得率为3.53%(n=3)，与预测值接近，说明了愿望函数优化所得到理论最佳工艺的可行性和有效性。

2.5 不同提取方法的比较 将本法与其它3种提取方法进行比较研究，料液比均为1∶25，各方法的提取条件分别为，乙醇-水回流法:乙醇浓度70%，回流时间1 h，提取温度80°C;乙醇-水超声提取法:乙醇体积分数70%，常温下超声50 min;双水相提取法:丙醇浓度55%，硫酸铵用量20%，静置过夜;超声耦合双水相提取法:丙醇浓度55%，硫酸铵用量20%，常温下超声50 min。结果如图3所示，结果表明，超声耦合丙醇-硫酸铵双水相体系用于提取竹叶兰中总黄酮物质，不仅用时短，常温下可进行，避免了某些活性成分因高温分解而损失，而且得率也高于其它方法，证明了超声耦合双水相体系的优越性，具有一定的实用价值。

图3 不同提取方法的比较Fig.3 Comparison of different extraction methods

3 结论

运用Design Expert软件进行星点设计-响应面分析，成功设计模型，得出了丙醇浓度和超声时间是影响竹叶兰中总黄酮物质得率的主要因素，丙醇浓度和硫酸铵用量之间存在着较强的交互作用。同时也获得了超声耦合丙醇-硫酸铵双水相体系提取竹叶兰总黄酮物质的最佳提取工艺:丙醇浓度为55%，超声时间为50 min，硫酸铵用量20%，在此条件下竹叶兰总黄酮得率为3.53%，与预测值基本相符，说明了用响应面分析法来设计最佳提取工艺的可靠性。

丙醇-硫酸铵双水相体系中，黄酮类物质应分配于上相有机相，而其它水溶性成分则分配于盐水下相中，从而在提取的同时也实现了黄酮类物质与某些无效成分如糖类等的分离，有效提高了产物的纯度。另外，在提取过程中，黄酮类产物转移至丙醇上相，可改变提取过程中的化学平衡，有利于更多黄酮类物质的溶出。因此，实验研究表明，超声波与丙醇-硫酸铵双水相体系可方便实现集成，并能缩短提取时间、提高效率，降低提取温度，避免了某些活性成分因高温分解而损失，获得了高纯度和活性的竹叶兰黄酮提取物，在傣药活性成分的提取分离方面展现了良好的应用前景。

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