不同转移特性的人鼻咽癌细胞株中Tiam-1表达及其意义

张香梅 陈培芬 刘 芳

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方及东南亚地区常见的1种恶性肿瘤，尤以广东省珠江三角洲一带多见，俗有“广东癌”之称。虽然近年来鼻咽癌的诊断和治疗水平已有很大提高，但鼻咽癌的5年生存率仍很低，究其原因，转移是导致鼻咽癌患者治疗效果和死亡的关键[1]。目前已发现与鼻咽癌转移有关的分子标志物主要有VEGF、CXCR4、CD44、Cadherin、MMP、nm-23、Wt-p53等[2]，有关T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1,Tiam-1)基因在鼻咽癌细胞株中的功能研究目前少有文献报道。本研究采用免疫细胞化学、RT-PCR等方法，分别检测不同转移特性的人鼻咽癌细胞株中Tiam-1表达，分析Tiam-1基因与人鼻咽癌细胞株转移特性的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

选择高成瘤高转移特性鼻咽癌细胞株5-8F、成瘤具有一定转移特性鼻咽癌细胞株CNE2 、C666-1以及成瘤无转移特性鼻咽癌细胞株6-10B(其中5-8F、CNE2、6-10B由中山医科大学肿瘤研究所建系、C666-1由香港中文大学建系)置南方医院肿瘤研究所细胞库冻存。浓缩型兔抗人Tiam-1多克隆抗体购自Santa Cruz公司；免疫组化SP-9000试剂盒、DAB显色试剂盒及磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)购自福州迈新生物技术有限公司；TRIzol和RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司；Tiam-1和GAPDH引物由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人鼻咽癌6-10B、C666-1、5-8F 和CNE2细胞均在37℃、5%CO2培养条件下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，选择生长状态良好的细胞用于实验。

1.2.2 免疫细胞化学方法 实验前一天胰酶消化6-10B、C666-1、5-8F 和CNE2细胞，调整细胞密度(2×105个/ml)后制作细胞爬片，次日待细胞约30%～50%融合时，弃去培养液，PBS冲洗后，4%多聚甲醛固定15 min，再用10%正常羊血清封闭30 min，不洗，然后加入Tiam-1一抗(1∶200稀释)，4℃过夜孵育。次日弃去一抗，PBS冲洗后加入酶标二抗(抗兔)，室温孵育1 h，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，最后用中性树脂封固。PBS液取代一抗作为阴性对照。

1.2.3 RT-PCR方法 待细胞长至状态良好，铺满瓶壁后用TRIzol试剂常规提取人鼻咽癌6-10B、C666-1、5-8F 和CNE2细胞总RNA； 1%琼脂糖凝胶电泳判断其完整性、分光光度计测定其浓度和纯度后，再各取1μg总RNA按照逆转录试剂盒操作生成cDNA，然后以此为模板各取1 μl，在94°C 40 s、60°C 30 s、72℃ 45 s条件下进行PCR反应，共30个循环。Tiam1引物为5′-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3′，5′-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3′，扩增片段为253 bp，看家基因GAPDH为内对照，引物为5′- AATCCCATCACCATCTTCCA -3′，5′- CCTGCTTCACCACCT TCTTG-3′ -3′，扩增产物为580 bp。

1.3 统计学分析

所有实验数据均采用SAS 6.12软件进行分析。完全随机设计多样本均数比较用方差分析，等级资料的相关关系用Spearman相关系数表示。

2 结果

2.1 不同转移特性鼻咽癌细胞株中Tiam-1蛋白表达

免疫细胞化学检测显示，Tiam-1蛋白在全部5-8F细胞胞质中呈棕黄、棕褐色强表达，在大部分6-10B细胞中呈微弱的淡黄色弱表达或不表达，在C666-1、CNE2细胞质中呈黄色中度表达。

2.2 不同转移特性人鼻咽癌细胞株中Tiam-1 mRNA的表达

所提取的4种人鼻咽癌细胞株总RNA，用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，结果表明其OD值(A260/280)均在1.8～2.0之间，电泳检测有3条清晰的rRNA带：28 s、18 s和5 s，说明RNA无降解，质量较好(图1)。

应用RT-PCR检测4种人鼻咽癌细胞株中Tiam-1 mRNA的表达，采用1-D ADVANCED软件进行区带的灰度分析，分别以Tiam-1和 GAPDH扩增带的密度比值表示各肿瘤细胞株的表达水平。结果表明Tiam-1基因在鼻咽癌高转移细胞株5-8F中的密度比值为0.817±0.040，无转移特性的细胞株6-10B中为0.103±0.015，C666-1、CNE2细胞中分别是0.383±0.025、0.497±0.047，差异有统计学意义(F=220.770，P<0.05)，且与转移特性的高低呈正相关关系(γs =0.852，P<0.05，图2，表1)。

图1 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性

图2 RT-PCR方法检测不同鼻咽癌细胞株中Tiam-1表达

表1 4种鼻咽癌细胞中Tiam-1基因的表达分析

△为采用SNK法，各种细胞间比较P均<0.05；γs为Spearman等级相关系数

3 讨论

Tiam-1基因是1种原癌基因，最初是从小鼠T淋巴瘤细胞高侵袭变异株中分离鉴定得到[3]。许多研究表明Tiam-1基因在多种恶性肿瘤组织中均有表达，且其表达水平与恶性肿瘤的侵袭转移能力密切相关[4～9]。Habets等[10]通过对不同淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等细胞株中Tiam-1表达进行的研究，发现Tiam-1基因表达与肿瘤细胞的侵袭转移特性有一定的联系。在鼻咽癌研究方面罗元等[11]曾对41例不同临床分期人鼻咽癌组织以及20例鼻咽粘膜慢性炎症组织中Tiam-1的表达进行分析，认为鼻咽癌组织中Tiam-1蛋白表达要高于鼻咽粘膜慢性炎症组织，并与鼻咽癌临床分期等具有相关性。在前期的研究中，我们曾利用脂质体转染法将含Tiam-1 cDNA的质粒分别转染CNE1和C666-1人鼻咽癌细胞，发现Tiam-1 蛋白过表达明显增强了转染细胞的黏粘附、迁移及侵袭能力[12]。因此，有关Tiam-1基因在不同人鼻咽癌转移细胞株中的表达及与细胞侵袭转移特性的关系值得研究。研究表明，同一恶性肿瘤组织可由不同的肿瘤细胞亚系组成，它们大多具有不同的生物学行为，表现出不同的临床和(或)病理学特性[13，14]。5-8F细胞株具有高成瘤、高转移特性[15]；6-10B细胞株具有成瘤、不转移特性[15]；CNE2、C666-1细胞株具有成瘤和一定的转移特性[16～18]。

本实验通过检测不同转移潜能的鼻咽癌细胞株中Tiam-1的表达，发现Tiam-1在具有高转移特性的5-8F鼻咽癌细胞中呈高表达，在没有转移特性的6-10B细胞中Tiam-1呈弱表达，而在具有一定转移能力的C666-1、CNE2细胞中Tiam-1呈中度表达，说明Tiam-1表达水平与鼻咽癌细胞侵袭转移能力呈正相关关系，与Bourguignon等[19]在乳腺癌、刘莉等[20]在结直肠癌、Engers等[21]在前列腺癌细胞系中研究所得出的结论一致，进一步验证了我们前期的研究结果[12]。

因此，Tiam-1可以作为判断鼻咽癌侵袭转移能力大小的1个参考指标。

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